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使用蛋白质印迹法分析 PTM 激活状态

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翻译后修饰 (PTM) 是一种关键的调节机制,可让细胞严格控制蛋白质功能。它们是可逆性共价修饰,这些修饰改变蛋白质状态,例如蛋白质折叠、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA 相互作用、蛋白质寿命、蛋白质定位和受体激活。这些行为转而控制多个生物过程,如酶活性、细胞周期、细胞凋亡和基因表达。

常见的翻译后修饰

一些常见的翻译后修饰包括磷酸化乙酰化甲基化。一个蛋白质可以在几个不同的氨基酸上发生不同修饰,而不同的 PTM 组合会导致不同的蛋白质行为。例如,p53 被多达 50 个单独的翻译后修饰修饰。

对 p53 融合蛋白进行蛋白质印迹法分析使用 Phospho-p53 (Ser15) Antibody #9284(上图)或 p53 Antibody #9282(下图)对未经处理或通过 DNA-PK 磷酸化的 p53 融合蛋白进行蛋白质印迹法分析。

p53 在 Ser15Ser20 位点的磷酸化可以阻断与 E3 泛素蛋白连接酶 MDM2 的相互作用,从而促进 p53 的积累和激活以应对 DNA 损伤;在 Ser46 上的磷酸化在凋亡诱导中起作用;Lys164 乙酰化可诱导细胞周期停滞;Lys373 上的乙酰化可导致 p53 N 末端残基过度磷酸化,进而增强 DNA 与促凋亡基因启动子的结合能力。

对其他蛋白质(如组蛋白)的 PTM 也类似地复杂。例如,Lys9 上组蛋白 3 的乙酰化在组蛋白配置和染色质组装中起主导作用,而 Ser10Ser28Thr 11 上的磷酸化与有丝分裂和减数分裂期间的染色体浓缩密切相关。组蛋白 3 甲基化转而主要与转录激活有关。然而,存在组蛋白 3 甲基化与抑制有关的场景。这只不过是蛋白质 PTM 所涉及的复杂性一瞥。

Phospho-Histone H3 (Ser10) Rabbit mAb使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) (D7N8E) XP® Rabbit mAb #53348(上图)或 Histone H3 (D1H2) Rabbit mAb #4499(下图)对未经处理或经 Nocodazole #2190(100 ng/ml,16 小时)处理的 Hela 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。抗体的磷酸化特异性使用 λ 磷酸酶进一步处理裂解物来显示。

扰乱调节蛋白质 PTM 状态的机制具有严重后果,并且在癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病中发现这种扰乱。然而,涉及了解修饰蛋白质的多种不同方式以及这些修饰的含义时,我们只不过才开始触及皮毛。

使用蛋白质印迹法进行 PTM 分析

那么,您如何监测样品中蛋白质的 PTM 状态呢?蛋白质印迹法特别有用,因为您可以使用高特异性抗体来评估总蛋白对特定残基的目的修饰。

没有时间寻找用于 WB 的理想抗体对?Cell Signaling Technology (CST) 已鉴定出用于评估蛋白质激活状态的修饰特异性二重抗体对。细胞可以用调节剂处理或在特定条件下培养以诱导特定细胞状态。然后,特异性 PTM 抗体可以确定与未处理的对照相比存在的修饰蛋白质的量,以及与蛋白质总量相比存在的修饰蛋白质的量。这可能会提供非常丰富的信息,但前提是您的 PTM 特异性抗体不会与同一蛋白质上的其他 PTM 发生交叉反应。此外,PTM 特异性抗体需要足够灵敏才能检测甚至低水平的修饰蛋白。

PhosphoPlus GCN2 (Thr899) Antibody Duet PairPhosphoPlus GCN2 (Thr899) Antibody Duet #26168:使用 Phospho-GCN2 (Thr899) (E1V9M) Rabbit mAb(上图)、GCN2 (E9H6C) Rabbit mAb #40457(中图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对未经处理 (-) 或已经过紫外线(50 mJ/cm2,30 分钟恢复;+)处理的 HT-1376 细胞提取物进行蛋白质印迹法分析。

蛋白质印迹法也非常灵活,因此您设计实验时会有数个选项。

  • 想要进行多重分析以节省时间或样品? 使用不同物种中产生的一抗和荧光偶联二抗对。如果您想重新分析膜,您也可以剥离膜并重新探测。
  • 想放大信号吗? 一种选择是使用生物素化一抗、生物素化二抗链霉亲和素-HRP,将更多过氧化物酶分子定位到蛋白质迁移的位置。
  • 需要对目的蛋白进行免疫沉淀分析吗? 使用与琼脂珠子偶联的一抗。或者使用您最喜欢的抗体和蛋白 A/G 琼脂糖或磁珠对目的蛋白进行免疫沉淀分析。

选择在蛋白质印迹法中使用哪种化学发光底物时,您甚至有很多选择,具体取决于您是要最大化信号还是信噪比。

用于 PTM 分析的经验证的蛋白质印迹法抗体

CST 是一家由像您一样的科学家组成的公司,因此我们知道您在蛋白质印迹法试剂中寻找什么。此外,我们所有的抗体都针对特定应用进行了验证,并且具有特异性、敏感性和可重复性 因此您可以专注于您的研究!

 

其他资源:

查看我们的蛋白质印迹法资源中心,在那里您可以找到 WB 实验步骤、疑难问题解决提示、应用说明等等。以下是我们认为应该对您有用的一些主题:

Andrea Tu 博士
Andrea Tu, PhD
Andrea Tu 博士是痴迷于了解最新科学趋势和发展的 Kallidus Group 科学营销部经理。她取得加州大学伯克利分校分子生物学与细胞生物学博士学位,在那里,她研究了 TGF-β 信号转导通路中的 Smad 翻译后修饰。20 年来,Andrea 先后在加州大学圣地亚哥分校、索尔克研究所、斯坦福大学、安捷伦科技公司和 Bio-Techne 从事研发、销售支持和营销等技术岗位。

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