使用蛋白质印迹法分析 PTM 激活状态

翻译后修饰 (PTM) 是一种关键的调节机制，可让细胞严格控制蛋白质功能。它们是可逆性共价修饰，这些修饰改变蛋白质状态，例如蛋白质折叠、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA 相互作用、蛋白质寿命、蛋白质定位和受体激活。这些行为转而控制多个生物过程，如酶活性、细胞周期、细胞凋亡和基因表达。

常见的翻译后修饰

一些常见的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化和甲基化。一个蛋白质可以在几个不同的氨基酸上发生不同修饰，而不同的 PTM 组合会导致不同的蛋白质行为。例如，p53 被多达 50 个单独的翻译后修饰修饰。

使用 Phospho-p53 (Ser15) Antibody #9284（上图）或 p53 Antibody #9282（下图）对未经处理或通过 DNA-PK 磷酸化的 p53 融合蛋白进行蛋白质印迹法分析。

p53 在 Ser15 和 Ser20 位点的磷酸化可以阻断与 E3 泛素蛋白连接酶 MDM2 的相互作用，从而促进 p53 的积累和激活以应对 DNA 损伤；在 Ser46 上的磷酸化在凋亡诱导中起作用；Lys164 乙酰化可诱导细胞周期停滞；Lys373 上的乙酰化可导致 p53 N 末端残基过度磷酸化，进而增强 DNA 与促凋亡基因启动子的结合能力。

对其他蛋白质（如组蛋白）的 PTM 也类似地复杂。例如，Lys9 上组蛋白 3 的乙酰化在组蛋白配置和染色质组装中起主导作用，而 Ser10、Ser28 和 Thr 11 上的磷酸化与有丝分裂和减数分裂期间的染色体浓缩密切相关。组蛋白 3 甲基化转而主要与转录激活有关。然而，存在组蛋白 3 甲基化与抑制有关的场景。这只不过是蛋白质 PTM 所涉及的复杂性一瞥。

使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) (D7N8E) XP^® Rabbit mAb #53348（上图）或 Histone H3 (D1H2) Rabbit mAb #4499（下图）对未经处理或经 Nocodazole #2190（100 ng/ml，16 小时）处理的 Hela 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。抗体的磷酸化特异性使用 λ 磷酸酶进一步处理裂解物来显示。

扰乱调节蛋白质 PTM 状态的机制具有严重后果，并且在癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病中发现这种扰乱。然而，涉及了解修饰蛋白质的多种不同方式以及这些修饰的含义时，我们只不过才开始触及皮毛。

使用蛋白质印迹法进行 PTM 分析

那么，您如何监测样品中蛋白质的 PTM 状态呢？蛋白质印迹法特别有用，因为您可以使用高特异性抗体来评估总蛋白对特定残基的目的修饰。

没有时间寻找用于 WB 的理想抗体对？Cell Signaling Technology (CST) 已鉴定出用于评估蛋白质激活状态的修饰特异性二重抗体对。细胞可以用调节剂处理或在特定条件下培养以诱导特定细胞状态。然后，特异性 PTM 抗体可以确定与未处理的对照相比存在的修饰蛋白质的量，以及与蛋白质总量相比存在的修饰蛋白质的量。这可能会提供非常丰富的信息，但前提是您的 PTM 特异性抗体不会与同一蛋白质上的其他 PTM 发生交叉反应。此外，PTM 特异性抗体需要足够灵敏才能检测甚至低水平的修饰蛋白。

PhosphoPlus GCN2 (Thr899) Antibody Duet #26168：使用 Phospho-GCN2 (Thr899) (E1V9M) Rabbit mAb（上图）、GCN2 (E9H6C) Rabbit mAb #40457（中图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对未经处理 (-) 或已经过紫外线（50 mJ/cm²，30 分钟恢复；+）处理的 HT-1376 细胞提取物进行蛋白质印迹法分析。

蛋白质印迹法也非常灵活，因此您设计实验时会有数个选项。

• 想要进行多重分析以节省时间或样品？ 使用不同物种中产生的一抗和荧光偶联二抗对。如果您想重新分析膜，您也可以剥离膜并重新探测。
• 想放大信号吗？ 一种选择是使用生物素化一抗、生物素化二抗和链霉亲和素-HRP，将更多过氧化物酶分子定位到蛋白质迁移的位置。
• 需要对目的蛋白进行免疫沉淀分析吗？ 使用与琼脂珠子偶联的一抗。或者使用您最喜欢的抗体和蛋白 A/G 琼脂糖或磁珠对目的蛋白进行免疫沉淀分析。

选择在蛋白质印迹法中使用哪种化学发光底物时，您甚至有很多选择，具体取决于您是要最大化信号还是信噪比。

用于 PTM 分析的经验证的蛋白质印迹法抗体

CST 是一家由像您一样的科学家组成的公司，因此我们知道您在蛋白质印迹法试剂中寻找什么。此外，我们所有的抗体都针对特定应用进行了验证，并且具有特异性、敏感性和可重复性 — 因此您可以专注于您的研究！

其他资源：

查看我们的蛋白质印迹法资源中心，在那里您可以找到 WB 实验步骤、疑难问题解决提示、应用说明等等。以下是我们认为应该对您有用的一些主题：

• 蛋白质印迹法实验设计技巧，其中包括荧光蛋白质印迹的注意事项。
• 靶标的阳性对照处理，它提供了可用作特定活化位点抗体阳性对照的处理方式的相关信息。
• 下载我们全面的蛋白质印迹法成功指南，了解用于生成更好的 WB 数据的其他技术。