CST 博客: 实验室展望

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确认抗体特异性的工具

您想要生成准确的结果。您已经计划好了您的实验,考虑了所有必要的试剂,并仔细检查了您是否使用了正确的对照品。您很高兴能更仔细地检查您的靶标,但您是否考虑过抗体的特异性?这是一些研究人员错过的一步。您可能已经看到您的试剂供应商的验证声明,但您如何确定您的抗体是特异性的?

敲除 (KO) 验证已做了大量工作。它可以成为展示蛋白质表达和抗体敏感性的强大工具。当人们确定哪些细胞系可表达我们的靶标时,就可以使用敲除。很遗憾的是,并不总是可以使用敲除系统。例如,许多蛋白质是细胞系生存所必需的,如果一种必需蛋白质被敲除,细胞系将不再存活。此外,一些细胞系不能用敲除试剂有效转染。如果靶标仅在“难以转染”的细胞系中表达,则不可能使用敲除工具进行抗体验证。如果 KO 系统不能用于抗体验证,制造商可以并且应该使用许多其他策略来验证抗体。

 

事实是,制造商可以使用许多策略来证明特异性,并且验证策略的组合对于真正进行验证是必要的。

我们通过精心定制验证策略的组合来保证我们的抗体:二元、范围、正交、多抗体、重组和互补。这意味着根据靶标的生物作用,定制我们的验证过程,考虑下游检测的敏感性要求,相应测试模型的可用性,以及每种方法与靶标研究的相关性。

 

二进制

 

二元方法是评估抗体特异性的最佳方法之一。通过在生物学上相关的阳性和阴性表达系统中测试抗体,可以确认它在其天然环境中识别靶抗原,而不会与样品中存在的其他生物分子发生交叉反应。二元模型包括元靶标蛋白表达已知或预计为阳性(高)或阴性(低)的内源细胞或组织、基因敲除、诱导或抑制蛋白靶标的表达或修饰的处理。

 

为了使二元检测有效,应始终使用正交法验证数据,例如基因测序以确认敲除或蛋白质组分析,以验证表达水平。为抗体性能具有最大信心,还应采用其他验证策略。此外,用于抗体二元验证的每个模型应在预期使用抗体的每次应用中进行测试 —— 只是因为抗体通过蛋白质印迹法检测具有特异性并不意味着它将通过免疫组织化学 (IHC) 检测具有特异性。例如,在进行蛋白质印迹法时,蛋白质和表位会变性,而在 IHC 中它们保持完整,但抗体在 IHC 中可以结合的表位可能会被掩盖。

 

范围

 

二元模型并不总是很容易获得,并且仅出于验证抗体的目的而生产可能既耗时又昂贵。而且,为了评估抗体在应用和实验中的敏感性,需要互补的标志。

 

适于此目的,范围策略包括使用有高、中和低表达水平表达目的靶标的内源性和异源性模型。范围策略对了解抗体的最佳工作条件至关重要。然而,它对整体抗体验证过程的重要性常常被忽略。范围策略和二元策略之间最重要(但细微)的区别是,范围模型依赖于靶标表达或修饰非黑即白的差异。通常,范围模型更能反映实际生物学,其中靶标的表达在一个细胞系或组织中相对于另一细胞系或组织而言高或低,或者仅通过激动剂或拮抗剂处理而被稍修饰。这意味着,尽管范围测试结果非常重要,但它们不如二元评估所产生的数据那样引人注目或易于解释。

 

正交

 

抗体验证的正交策略涉及将基于抗体的结果与基于非抗体方法获得的数据进行交叉对照。这种方法对确认现有抗体验证数据至关重要,并可确定与存疑抗体直接相关的任何影响或伪影响。在其最简单的形式中,正交策略规定使用其他策略获得的结果需要通过非基于抗体的检测方法来证实。作为一个示例,通过二元或范围策略观察到的靶标的阳性和阴性表达应始终使用正交方法进行确认,例如通过基因测序确认敲除或对 mRNA 进行转录组分析以确认表达。

 

多抗体

 

多种抗体策略是一种强大的抗体验证方法。实现此目标的最常见方法之一是使用一种抗体进行靶标的免疫沉淀 (IP),然后通过用另一种针对相同靶标的抗体进行蛋白质印迹分析检测。这提供了两种抗体结合正确蛋白质的信心。

 

多种抗体验证的另一种熟悉方法涉及使用针对同一靶标上不同、不重叠表位的两种或多种抗体,以产生直接可比的免疫染色数据。这通常通过蛋白质印迹,免疫细胞化学或免疫组织化学等技术来证明。通过平行地用多种抗体检测相同的样品,可以相对快速直观地了解抗体特异性。

 

重组

 

对于蛋白质表达非常低或未知的抗原靶标,可能需要在替代细胞系中使用重组蛋白或异源表达来进行抗体验证。尽管内源系统由于更能代表体内条件而被优选,但重组策略提供了许多优势。

 

首先,重组策略可用于验证抗体与蛋白同种型或保守家族成员的交叉反应性,从而提供有关基于抗原同源性的抗体脱靶结合潜力的有用信息。重组策略也可用于通过表达或稀释来滴定靶蛋白,从而测试抗体的敏感性。

 

补充

 

根据所研究的抗原靶标和所使用的应用,建议在抗体验证中采用补充策略。这些方法可以提供有关抗体特异性或功能性的重要信息,并可以根据靶标的生物学特性以及下游分析的确切要求进行精心定制。

 

补充策略包括使用肽阵列和/或 ELISA 确定抗体对翻译后修饰 (PTM) 的特异性,以及各种封闭i肽方法来阻止抗体与特定抗原结合。实验步骤优化也包括在补充策略标志之内,包括中和作用或使用抗体作为激动剂激活蛋白质等各种功能检测。所有这些方法都提供了补充数据,以支持使用其他验证标志实验得出的结果。

 

评估您的试剂

 

没有一种验证策略比另一种更好,这里讨论的任何方法都不应该孤立地使用。每个基于抗体的应用均提供一组独特的条件,对于抗体的特异性、敏感性和功能性具有截然不同的难点。例如,通过蛋白质印迹显示出优良特异性的抗体在免疫组织化学测定中可能是非特异性的,或者在功能测定中是无效的。这强调了使用与预期模型系统中所需应用一致的策略和实验步骤验证每个单独抗体的重要性。CST 结合使用所有这些方法来验证我们的每一种抗体。如果您无法确定您使用的抗体是否通过了这一级别的验证,您应该考虑自行验证。

 

详细了解抗体验证策略

Chris S
Chris S
Chris Sumner 是《实验室展望》的主编。不阅读或撰写治疗疾病的内容时,他总是在林间漫步、弹吉他,或者寻找世界上最棒的龙虾卷。

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