没有办法解决这个问题：选择正确的抗体可以决定您的实验成败。如果您选择的试剂不加区分地与多个靶标结合或对您的目的蛋白的亲和力较低，那么即使您的实验方法万无一失并且您完美地执行了实验步骤，您仍然会得到不准确的结果。
“在神经科学相关蛋白质的抗体中……多达三分之二的试剂未能按照制造商的建议发挥预期作用。”~Ayoubi 等人，2023 年
当您使用来自信誉良好供应商的抗体试剂时，可能会理所当然地认为其性能符合预期，并能准确表征样本中靶标的存在。遗憾的是，事实并非如此简单。
抗体并非总是可靠
独立研究团队一再发现，抗体质量问题在很大程度上是导致可重复性危机的重要因素之一。蒙特利尔神经学研究所（麦吉尔大学神经研究所）Distinguished James McGill Professor Peter McPherso 实验室发起的通过开放科学进行抗体表征（YCharOS，发音为“Icarus”）小组在对 600 多种神经科学相关蛋白抗体的初步分析中发现，超过一半的试剂未能按照制造商的建议发挥作用。1全球市场上约有 770 万种研究抗体产品，由近 350 家供应商生产，这意味着目前销售的研究抗体中，可能有超过 500 万种在实验中无法按预期发挥作用。
单是这一数字就足以让人感到不安。然而，最具挑战性的问题——也是让许多研究人员夜不能寐的关键问题在于，仅凭单组实验数据往往很难，甚至几乎不可能判断抗体是否真正发挥作用。假阳性或假阴性可能看似反映准确的结果，甚至最终被发表。
事实上，没有任何实验应用能够完全避免劣质抗体试剂的影响。例如，YCharOS 发现，制造商推荐用于蛋白质印迹法 (WB) 的抗体中，有一半以上未能按预期起作用——它们要么无法检测到预期的靶标，要么除了靶标以外还检测到不相关的蛋白。
“遗憾的是，有成千上万篇研究论文——甚至是那些发表在享有盛誉的出版物上的文章——都是基于无效抗体的结果，”YCharOS 联合创始人 Carl Laflamme 博士说：“当然，作者们并未意识到他们的研究结果可能不准确，而这些论文往往会被后续研究引用，从而进一步加剧科学可重复性危机。”
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Laflamme 在做肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 博士后研究期间，亲身经历了这一问题，这最终激励他创立了 YCharOS。在进行博士后研究期间，他惊讶地发现，目前所有关于某种疑似与该疾病相关基因的研究，所使用的抗体实际上并未与蛋白靶标结合，这一发现是通过他和同事的测试得出的。
YCharOS 运营总监 Riham Ayoubi 博士表示：“当研究人员使用无效的抗体时，不仅浪费了时间，还可能造成混乱，最终花费更多时间来解决这些问题，甚至可能比根本没有发表研究更为耗时。”“这个问题已经存在了几十年，它可能导致潜在的挽救生命的治疗方法研发进程被延误。我们希望研究人员开始认识到这些问题，而且 YCharOS 能帮助他们选择有效的试剂。”
如何为您的实验选择正确的抗体
最近，YCharOS 在《Nature Protocols》上发表了一篇论文，描述了一种抗体表征策略，用于验证抗体在三种最常见的应用——蛋白质印迹法、免疫沉淀法和免疫荧光法中的表现。2
作为论文中既定计划的一部分，YCharOS 正在与学术机构和抗体制造商（包括 Cell Signaling Technology）合作，重新测试市售抗体。
“作为我们持续重新验证抗体的标准流程的一部分，我们与 YCharOS 团队合作，使用他们的表征平台进行测试时，每种 CST 试剂的表现都符合 WB 的预期，这让我们感到高兴，但并不意外，”CST 资深科学家 Srikanth Subramanian 博士说道。
由于行业中存在如此多的混乱，了解抗体验证和为实验选择合适的试剂可能是一项艰巨的任务。使用一些简单的原则来完成任务，可以帮助确保您选择的抗体能够在您的实验模型中发挥作用。
以下是有关如何选择可信赖抗体的提示：
1. 审查供应商的特定应用验证数据
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当开始一个新的研究项目时，研究人员可能会根据之前使用某种特定抗体的经验轻松做出选择。然而，仅仅因为抗体在某一应用中有效，并不意味着它在其他应用中也能同样发挥作用。 ~ Katherine (Katie) Crosby，CST 抗体应用与验证高级总监 |
在特定应用制造商数据中寻找什么
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染色质免疫沉淀法 (ChIP)：对至少两个已知阳性位点和一个已知阴性位点进行免疫富集，结果显示，已知阳性位点与已知阴性位点相比，具有最佳信噪比的最小倍数富集（在抗体与同种型对照比较中的靶标位点免疫富集）。 |
| ⇒ | 免疫组织化学法 (IHC)： 清晰、特异性染色定位于正确的组织，具有最小的背景以及适当的阳性和阴性对照。 |
| ⇒ | 免疫荧光法 (IF)： 正确定位细胞中的信号，可能在组织环境中，具有最小的背景噪音和适当的阳性和阴性对照。 |
| ⇒ | 流式细胞术： 根据蛋白质表达水平、最佳信噪比 (S/N) 以及适当的阳性和阴性对照精确识别细胞群。 |
| ⇒ | 免疫沉淀法：针对靶标蛋白的强烈而特异的信号，具有最小的背景噪音，包括适当的阳性和阴性对照。 |
| ⇒ | 蛋白质印迹法 (WB)：具有正确靶标分子量的清晰、特异性条带，具有最小的背景，以及适当的阳性、阴性和上样对照。 |
2. 利用可靠的第三方数据
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“除了 YCharOS，还有许多可靠的组织提供第三方验证数据。请与这些组织核实，看看您考虑使用的抗体是否已经由任何第三方供应商在您使用的应用和动物模型中进行了验证。” ~ Carl Laflamme 博士，YCharOS 联合创始人 |
以下组织因其可靠性而广受认可
3. 验证您的实验模型并了解您的靶标
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“了解目的蛋白靶标并使用适当的对照对于确保实验的准确性至关重要。这一过程能够验证您的结果是否真正反映了预期的生物学过程，并对实验成功起到关键作用。 这意味着您需要全面审查现有的研究和数据库，深入了解靶标的已知功能、相互作用以及在特定疾病状态下的表达水平，从而设计出一个实验，使得任何观察到的变化都直接与靶标蛋白的操作相关，而非由外部变量或脱靶效应所致。” ~ Srikanth Subramanian 博士，CST 资深科学家 |
选择和验证实验模型时需要研究的问题
CST 抗体脱颖而出
在 CST，我们始终重视抗体的质量而非数量，我们非常自豪每种抗体的引用量比任何其他供应商都多。
“细致的抗体验证是我们工作的核心，这也是 CST 抗体在过去的 25 年里始终树立可靠性能标准的原因，”Subramanian 说道：“基于我们自己的验证实验以及通过 YCharOS 等第三方组织的测试，我们很自豪地保证，当按照数据表上所述使用推荐的方案时，我们的抗体能够发挥作用——无论是第一次还是每一次。”
我们常听到研究人员说，当他们看到抗体瓶上的“CST 蓝色”盖子时，他们就知道这是一种真正值得信赖的抗体。25 年来，我们的试剂一直以可靠性能树立行业标准。我们为这一传统感到无比自豪，并且我们计划在未来 25 年继续发扬这一传统。
选择以下参考文献
- Ayoubi R, Ryan J, Biddle MS, et al. Scaling of an antibody validation procedure enables quantification of antibody performance in major research applications. Elife. 2023;12:RP91645. Published 2023 Nov 23. doi:10.7554/eLife.91645
- Biddle MS, Virk HS. YCharOS open antibody characterisation data: Lessons learned and progress made. F1000Res. 2023 Oct 16;12:1344. doi: 10.12688/f1000research.141719.1. PMID: 37854875; PMCID: PMC10579855.
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