从 PCR 到 ChIP-seq：如何分析您的 ChIP DNA

本系列的第 1 部分描述了在您的实验步骤中加入适当对照的重要性。在第 2 部分中，我们讨论了染色质制备如何影响最终实验结果。在接下来的帖子中，我们将探讨免疫沉淀抗体，现在我们从分析数据开始。

有多种方法可以用来分析经目的蛋白靶标免疫沉淀得到的纯化 DNA。我们将在下文中介绍两种最常使用的方法。

实时 PCR

使用标准或定量实时 PCR 方法来分析纯化的 DNA。对免疫富集的纯化 DNA 进行 PCR 分析，可让使用者在不同生物条件下分析某种特定的目的蛋白-基因相互作用。这些实验需要对目的区域具有特异性的引物，因此富集数据限于被扩增的小基因组位点。

使用随实时 PCR 仪器一起提供的软件来分析 PCR 结果。或者您可以使用下面所示的等式手动计算免疫沉淀效率，在该等式中，信号表示为占总输入染色质的百分比。

ChIP-公式

下一代测序分析 (NGS)

在使用一个称为 ChIP-seq 的实验步骤进行的 ChIP 之后，可使用下一代测序分析 (NGS) 来分析经免疫沉淀的 DNA。ChIP-seq 为使用者提供一个有关蛋白/DNA 相互作用的高分辨率、全基因组视图，这是使用实时 PCR 无法实现的。例如，在下面的实验中，使用针对活性组蛋白标记物 H3K4me3、非活性组蛋白标记物 H3K27me3 和 Ezh2（一种使 H3K27me3 标记物沉积的多梳转录因子）的抗体进行免疫沉淀。Ezh2 已知会结合 HoxA 基因簇，但不结合 GAPDH 基因，实时 PCR 和下一代测序分析均证实了这一点。(I)

重要的是，实时 PCR 方法只能检测预先选择的基因组位点，而 NGS 则可让研究人员产生一个有关基因组中 H3K4me3 和 H3K27me3 标记及 Ezh2 结合位点的表达谱。使用这种方法获得的大量信息使 ChIP-seq 成为一种强大的技术，以研究正常发育或病理状态期间出现的表观遗传变化。