开发研究抗体是一个浩大过程，它利用动物的适应性免疫应答产生与目的分子结合的试剂探针。抗体科学家利用适应性免疫系统的这种独特能力鉴定和制造用于各种免疫测定的抗体试剂，这些试剂代表可用于研究生物样本的一些最强大技术。
然而，鉴定和开发针对相关目标既特异又灵敏结合的抗体试剂可能耗时数月甚至数年研究、实验和验证。CST 的抗体科学家在自身了解疾病方面主动与持续进行的治疗趋势和发展状况保持同步。产品开发科学家利用他们的洞见和预测提供目选择信息，并提前数年开始寻找针对数百种有希望靶标的高特异性、高灵敏度抗体。
相关资源：验证标志电子书
实体瘤的细胞疗法难题
包括嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞、抗体药物偶联物 (ADC)、mRNA 疫苗、T 细胞重定向双特异性抗体和细胞活化性双特异性抗体在内的靶向免疫疗法已成功治疗白血病等血癌。然而，开发细胞疗法治疗诸如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等癌症中的实体瘤仍然难以实现。尽管此类型癌症罹患者占据压倒性主体，但截至 2023 年，尚无靶向实体瘤的成功工程化细胞疗法。
免疫疗法通过指导身体免疫系统瞄准含有指定标记物的细胞发挥作用。该疗法依赖于鉴定存于肿瘤中，但重要地是健康组织中未发现的细胞标记物。找到正确的分子靶标是科学家在新疗法研期间面临的最大障碍之一。每当发现潜在的新靶标时，开发研究新靶标所需抗体研究工具的比赛就开始了。
此外，FFPE 组织样本的免疫组织化学 (IHC) 分析是实体瘤研究的关键组成部分。IHC 对于抗体开发来说是始于以下的艰难应用：相比诸如蛋白质印迹法 (WB) 和免疫荧光 (IF) 等其他技术，组织样品及其专化制备过程的复杂性要求科学家小心迫近用于 IHC 的抗体验证，以确保特异性和灵敏度。以下是我们才华横溢的 CST 科学家团队如何开发经 IHC 验证的密封蛋白-6 抗体的故事，密封蛋白-6 是近年来免疫肿瘤学中已备受关注的药物靶标。
经 IHC 验证的 密封蛋白-6 研究抗体开发竞赛
紧密连接蛋白的密封蛋白家族成员—密封蛋白-6 (CLDN6) 是近年来已备受关注的新靶标。它在胚胎发育和胎儿发育期间表达，但通常在成体组织中转录性沉默，在几种上皮癌（包括卵巢癌、睾丸癌和子宫内膜癌）的表面再表达。密封蛋白-6在正常成体组织中不存在，而存在于肿瘤中，这使其成为免疫肿瘤学研究的良好靶标。
虽然密封蛋白-6 在 20 世纪 90 年代首次发现，但直到最近人们对该靶标的兴趣才骤然增加。目前，BioNTech、Xencor、NovaRock、Amgen、I-Mab、Chugai、Daiichi Sankyo 和 AbbVie 都有探索其治疗潜力的研究项目。
CST 科学家一直追踪探索这种迷人靶标的肿瘤学功能的早期研究，并启动抗体开发活动，企图鉴定可能为研究该靶标的研究人员使用的 密封蛋白-6 特异性抗体。在研究阶段使用特异而灵敏的抗体对后续开发安全和成功的免疫疗法至关重要，从而工程化的 T 细胞不靶向健康组织。例如，虽然 密封蛋白-6 在成体组织中罕见表达，但一种密切相关的蛋白质，密封蛋白-9 (CLDN9) 在结构上类似于密封蛋白-6 并且遍及全身高水平表达。
除了特异性和灵敏度之外，一款成功的密封蛋白-6 抗体还需要在 IHC 测定法中有效，原因在于这项技术广泛用于免疫肿瘤学研究中。
鉴定和验证抗密封蛋白-6 单克隆抗体
成功鉴定一款在多种应用（包括 IHC）中有效的密封蛋白-6 单克隆抗体之前，CST 科学家启动了多个项目。
为了开始搜索，使用一个二元模型系统，该系统证明靶标在细胞系 OVCAR-3 (+) 中过度表达以及在细胞系 DU 145 (-) 中低表达或阴性表达。接下来，使用数百份抗体样品进行蛋白质印迹，以寻找在 OVCAR-3 衍生的裂解物中检出具有正确分子量（在密封蛋白-6 的情况下 23 κDa）的蛋白质并且在 DU 145 衍生的裂解液中显示无信号的抗体。
CST 首席科学家 Susan Kane 博士讲述了这个故事，“一旦依据 WB 认定单克隆抗体候选者有前景，我们就在目的应用中使用类似的二元系统以及确认抗体特异性和灵敏度的其他验证策略测试它们，例如筛选相关疾病状态下目的组织中的表达水平。”
使用 CST® Hallmarks of Antibody Validation™ 策略，团队能够验证用于的 WB、免疫沉淀 (IP) 和免疫荧光 (IF-IC) 的单克隆抗体：Claudin-6 (E2S5M) Rabbit mAb #62831。
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图 1. 产品 Claudin-6 (E2S5M) Rabbit mAb #62831 的一些验证数据。左侧：使用 #62831 对 OVCAR-3 细胞和 DU 145 细胞进行 IF 分析。右侧：使用 #62831（上图）和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对来自 OVCAR3 细胞和 DU 145 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。如预期，DU 145 的密封蛋白-6 表达低或为阴性。
然而，依据 WB 筛选鉴定的所有初始性克隆在 IHC 验证期间均告失败，如图 2 中所示。“针对许多应用筛选抗体克隆是一个艰巨过程，尤其对 IHC 为最甚，”Susan 解释道：“对于 IHC，测试过程的错综复杂性因组织固有复杂性而增加。我们的 IHC 科学家经常针对给定目标查看数百个克隆，搜索载玻片上的染色模式，以辨识相似性、差异、不一致性和奇异处等等。”
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图 2. 使用 Claudin-6 (E2S5M) Rabbit mAb 对石蜡包埋的 OVCAR-3 细胞沉淀物（左图，阳性）或 DU 145 细胞沉淀物（右图，阴性）进行免疫组织化学分析。在第一个稀释点，两种细胞沉淀物中均观察到非特异性核信号。借助滴定，非特异性信号大多从阴性细胞中消除，但强烈的核信号仍留在一些 OVCAR-3 细胞中，同时有限的特异性信号保留。克隆 E2S5M 未针对 IHC 验证过。
为何经证明在 WB、IP 和 IF 中有效的抗体在 IHC 中验证失败？
由于不同应用实验步骤的样品制备存在变异，每种应用中独立验证是确保抗体在该应用中将有效的唯一方法。1这在 IHC 中尤其重要，因为组织处理可能大大影响抗体反应性。制备FFPE 组织期间福尔马林固定影响靶标抗原的抗原性，原因是形成亚甲基桥，后者可能改变蛋白质构象和抗原结合位点（表位）。2尽管抗原修复技术，例如使用蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶 K）或加热，可以部分地恢复抗原反应性，但事实仍是，相比其他应用类型，FFPE 样品中的抗体性能可能大幅度变动，尤其是免疫细胞化学 (ICC) 等细胞测定法。
“像我们在 CST 那样严格验证抗体的部分难题是我们在各种组织类型中寻找已知的表达”Susan 解释道：“然而，对于预期表达仍旧处于研究并且正在发现非同寻常结果的顶级靶标如密封蛋白-6，真实验证抗体是否符合我们的标准可能有挑战性。为了确保我们的 IHC 抗体结合于且结合于密封蛋白-6，我们必须富于创意并采用额外方法如 LC-MS（液相色谱-质谱法）蛋白质组学，确认我们的结果。”
寻找经 IHC 验证的密封蛋白-6 抗体同时，CST 的另一个内部团队已经努力工作，使用 LC-MS 分析密封蛋白-6 水平，以鉴定表达密封蛋白-6 的 FFPE 肿瘤块。利用产生的大量蛋白质组学数据，IHC 团队能够利用经测定具有高、中和低 密封蛋白-6 表达水平的额外组织样本，找到有希望的抗体克隆。一旦对大量患病组织和正常组织进行多轮测试后鉴定到有希望的克隆，则质谱表征的组织中所获得的染色模式有助于确认这些克隆是否特异性着染密封蛋白-6。
在多次回到起点从头开始设计并重新测试已在不同开发阶段及出于各种原因失败的抗体，团队终于挖到了金子（抗体）：一种经证明在 IHC 应用中 FFPE 组织上特异而灵敏地有效作用的单克隆抗体。
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图 3. 对各种石蜡包埋的以下人组织进行 IHC 分析：使用 Claudin-6 (E7U2O) XP® Rabbit mAb 时卵巢的浆液性乳头状癌组织（左上图）、唾液腺的小细胞癌组织（中上图）、甲状腺乳头状癌组织（右上图）、肝细胞癌组织（左下图）、非霍奇金氏淋巴瘤组织（中下图）和肺肉瘤组织（右下图）。
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图 4. 对各种石蜡包埋的以下正常人组织进行 IHC 分析：使用 Claudin-6 (E7U2O) XP® Rabbit mAb 时胎盘组织（左上图）、阑尾组织（中上图）、食道组织（右上图）、脑组织（左下图）、胰腺组织（中下图）和扁桃体组织（右下图）。
该过程的最后一步是确保克隆 E7U2O 与结构相似的蛋白质（例如 密封蛋白-9）无交叉反应性。在 WB 和 IHC 中实施了额外测试，以确认克隆 E7U2O 与密封蛋白-6 反应并且仅与之反应。该克隆最终成为 Claudin-6 (E7U2O) XP® Rabbit mAb #18932。
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图 5. 使用 Claudin-6 (E7U2O) XP® Rabbit mAb（上图）或 DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb #14793（下图），对石蜡包埋的未转染（左图）或经密封蛋白-9（右图）转染的 293T 细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。
“CST 抗体开发和应用科学家的作用是试图让抗体候选物失败，”Susan 解释道：“当我们测试了所能想到的每种可能性而抗体仍按预期工作时，我们就知道它确实特异和灵敏到足以向客户发布。最终获得 IHC 合格的抗体克隆如 E7U2O 比享受生日蛋糕和气球更令人开心！”
用于 IHC 的密封蛋白-6 高度特异性单克隆抗体是研究成人实体瘤新治疗方法的关键工具。籍此针对 IHC 验证 CST 抗体的严格性可以提高所产生结果的置信度和可靠性，有望在未来带来新的治疗可能性。
访问 CST® 产品目录，更多了解 Claudin-6 (E7U2O) XP® Rabbit mAb #18932 。
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选择以下参考文献
- Mariaville C, Martineau P. Antibody Identification for Antigen Detection in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Using Phage Display and Naïve Libraries.
Antibodies (Basel). 2021;10(1):4. Published 2021 Jan 14. doi:10.3390/antib10010004 - Bayer, M., Angenendt, L., Schliemann, C., Hartmann, W., & König, S. (2019). Are formalin-fixed and paraffin-embedded tissues fit for proteomic analysis? Journal of Mass Spectrometry, 55(8).
- Chen A. In the search for therapies for solid tumors, companies are turning to a novel target: claudin-6. STAT. https://www.statnews.com/2023/01/18/cancer-therapies-solid-tumors-claudin-6-cldn6/. Published 2023 年 1 月 18 日. Accessed 2023 年 9 月 25 日.
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