抗体验证要点：正交策略

抗体验证的正交策略涉及将基于抗体的结果与基于非抗体方法获得的数据进行交叉对照。近年来，该方法获得了越来越多的关注，CiteAb 报告了超过 14,000 个供应商针对商业抗体进行正交验证的实例。

本文阐述了正交验证策略为何成为抗体验证的关键环节，并展示 CST 科学家在抗体开发与测试全流程中运用正交数据的具体案例。 

目录：

• 什么是正交抗体验证？
• 正交数据的实验来源
• 正交数据的公共来源
• 使用公开组学数据的正交验证实例
• 使用质谱数据的正交验证实例

什么是正交抗体验证？

在统计学中，“正交”一词指变量间统计独立的状态——简言之，即两个数值不存在关联性。这一概念同样适用于抗体正交验证：当抗体依赖性实验获得的数据，能够被非抗体依赖的实验方法所验证时，即构成正交验证。正交数据来源可包括挖掘已发表的研究成果、通过组学技术（基因组学、转录组学和蛋白质组学）研究基因表达，以及采用原位杂交等其他成熟的抗体非依赖性方法。

“正交验证的原理类似于使用参考标准来验证测量结果，”CST 抗体应用与验证高级总监 Katherine (Katie) Crosby 解释道，“就像需要用不同的校准砝码来检查天平是否准确一样，我们需要抗体非依赖性数据进行交叉比对，以验证抗体驱动实验的结果。采用不相关方法获得的数据有助于控制偏差，从而为靶标特异性提供更具说服力的证据。”

正交数据只是国际抗体验证工作组提出的“抗体验证五大概念支柱”之一，该框架已被学界广泛认可并采纳。¹ CST 将这些支柱统称为抗体验证标志，它们包括以下实验方法：二元验证（如基因敲除验证）、范围验证、互补验证、异源验证、多抗体验证和正交验证。

举例来说，假设您首次需要在蛋白质印迹 (WB) 实验中使用某种抗体。您可以将人类蛋白质图谱数据库作为正交数据来源，筛选具有高低 RNA 表达水平的候选细胞系（即二元实验模型）。若蛋白质印迹结果与 RNA 数据不符，则需进一步探究。下面展示了 Nectin-2/CD112 验证过程中成功的蛋白质印迹实验案例。

二元验证策略通过测试已知靶标蛋白阳性 (+) 和阴性 (-) 表达的系统（如内源性细胞、基因敲除或诱导/抑制表达模型）来评估抗体特异性，以确认靶标识别且无交叉反应性。

“最高标准的正交验证意味着采用多种独立实验技术并交叉比对数据来验证抗体实验，”CST 高级科学家 Srikanth Subramanian 博士解释道，“虽然额外的工作需要投入更多精力，但绝对物有所值。”由于对抗体特异性和敏感性有了信心，CST 才会在抗体验证活动中尽可能地使用正交数据。”

但需特别注意的是，应用特异性验证至关重要。虽然上述二元实验可用于验证抗体在蛋白质印迹中的特异性和敏感性，但并不能确认其在免疫组织化学 (IHC) 等其他应用中的表现。不同应用所用的样品制备和保存步骤可能会以不同方式影响抗原，最终改变抗体与表位的结合特性，从而影响其功能。

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抗体非依赖性正交数据的实验来源

以下实验技术可作为获取靶标蛋白或其对应基因正交数据的范例，这些方法均无需使用抗体即可实现检测或定量：

• 原位杂交：通过标记核酸探针检测组织或细胞中特定 DNA 或 RNA 序列的存在。
• RNA 测序： 运用 mRNA 富集、cDNA 合成和下一代测序分析，定量分析样本中的 RNA 表达水平。
• 定量 PCR：采用 DNA 引物对特定 DNA 序列进行扩增与定量分析。
• 质谱分析： 依据质荷比对蛋白质进行鉴定与定量分析。

抗体非依赖性正交数据的公共资源

以下为开放获取的公共数据库范例，涵盖各类疾病状态、生物模型及组织类型的非抗体生成数据：

• 癌细胞系百科全书 (CCLE)：该百科全书由 Broad Institute 维护，向公众提供 1,100 余种癌细胞系的基因组数据及分析工具。
• BioGPS： 一个集成分布式基因注释资源的中央基因门户，提供可定制的基因报告和各种基因特定资源的访问。
• 人类蛋白质图谱：瑞典主导的跨国研究计划，整合抗体成像、质谱蛋白质组学、转录组学及系统生物学等组学技术，全面绘制人体细胞、组织与器官的蛋白质分布图谱。
• DepMap 门户网站： Broad Institute 搭建的公共资源与研究平台，致力于通过提供全面数据集和工具来识别肿瘤脆弱性特征与潜在治疗靶点，从而加速精准癌症医学的发展。
• COSMIC（癌症体细胞突变目录）：权威收录各类癌症体细胞突变信息，详细解析突变类型及其致癌机制。

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使用公开组学数据的正交验证实例

通过蛋白质印迹法（抗体依赖性方法）检测的蛋白表达水平，与人类蛋白质图谱数据库（抗体非依赖性方法）公开的组学数据完全吻合，符合预期。

以下是 CST 科学家验证重组单克隆抗体克隆 D8D3F（靶向 Nectin-2/CD112）用于蛋白质印迹实验时生成的抗体验证数据范例。

Nectin-2（亦称 CD112）是一种多功能蛋白，在细胞黏附、T 细胞信号传导、心脏功能和病毒入侵等多种过程中发挥关键作用。为确认该抗体克隆在蛋白质印迹中的特异性，研究团队首先参考人类蛋白质图谱的正交数据，确定了 Nectin-2 在不同细胞系中的预期相对表达水平（如图 1 所示）。

图 1. 人类蛋白质图谱中不同细胞系 Nectin-2/CD112 的 RNA 标准化表达数据。注意三个图表中 nTPM 值的差异。(www.proteinatlas.org/ENSG00000130202-NECTIN2)

基于人类蛋白质图谱数据，研究人员选取以下四种细胞系进行抗体测试：

• 高表达组：RT4（人膀胱癌细胞系）和 MCF7（人乳腺癌细胞系）显示 Nectin-2 RNA 水平明显升高。
• 低表达组：HDLM-2（霍奇金淋巴瘤细胞系）和 MOLT-4（急性淋巴细胞白血病细胞系）呈现极低 Nectin-2 RNA 表达。

随后，研究人员使用该抗体克隆对四种细胞系样本进行蛋白质印迹实验。图 2 结果显示，RT4 和 MCF7 细胞系中可清晰观察到预期的高表达水平，而 HDLM-2 和 MOLT-4 细胞系中几乎检测不到表达信号。

图 2. 左图：使用 Nectin-2/CD112 (D8D3F) #95333（上图）和 β-Actin (D6A8)（下图）对 RT4、MCF7、HDLM-2 和 MOLT-4 细胞提取物进行的蛋白质印迹分析。

上述结合正交数据和二元验证策略的实验设计，充分证实了 Nectin-2/CD112 (D8D3F) #95333 在蛋白质印迹应用中的特异性。但需注意的是，该抗体在其他应用场景的特异性仍需额外验证——事实上，CST 科学家已通过补充实验确认该克隆适用于免疫组织化学 (IHC)，但不建议拓展至其他应用领域。 

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使用质谱数据的正交验证实例

通过免疫组织化学（抗体依赖性方法）分析的蛋白表达水平，与通过质谱检测（抗体非依赖性方法）获得的肽段计数结果一致。

由于组织的固有复杂性，免疫组织化学抗体的验证工作面临特殊挑战。CST 对新型 IHC 抗体进行系统化验证测试，以确保其对预期靶标的特异性和敏感性。虽然液相色谱-质谱联用技术 (LC-MS) 尚未在所有实验室普及，难以作为研究者自主独立抗体验证的常规手段，但我们发现该技术在内部验证过程中能提供极具价值的正交数据支持。

本研究采用 LC-MS 数据验证 CST 抗体克隆 E3J5R（靶向 DLL3，即 Delta 样配体 3）在免疫组织化学应用中的可靠性。通过对小细胞肺癌样本进行 LC-MS 分析，获得如图 3 所示的 DLL3 肽段计数结果。我们据此筛选出高（蓝色）、中（黄色）、低（绿色）三个 DLL3 肽段计数水平的样本进行免疫组织化学分析。

图 3.结合 iBAQ（基于强度的绝对定量）和 TOMAHAQ（触发式偏移多路精确质量高分辨绝对定量）方法，通过 LC-MS 分析获得的不同组织 DLL3 肽段计数。

如图 4 所示，采用 E3J5R 抗体进行免疫组化检测的 DLL3 蛋白表达水平，与 DLL3 肽段计数结果呈现相关性。绿色标记组织在 IHC 染色中几乎检测不到靶标蛋白表达，蓝色标记组织显示高丰度靶标蛋白表达，而黄色标记组织呈现中等程度的染色强度，这与预期完全吻合。

图 4.使用 CST 重组单克隆抗体 DLL3 (E3J5R) Rabbit mAb #71804 对三种 LC-MS 筛选组织进行 IHC 分析，分别显示低（绿）、中（黄）、高（蓝）水平的蛋白表达。

基于抗体的 IHC 检测与抗体非依赖性质谱数据之间的比对分析，证实了三种组织样本间蛋白表达丰度的强相关性。虽然 #71804 抗体的性能验证不仅限于此，但正交数据的引入为该试剂在 IHC 应用中的可靠性和稳定性提供了更高层级的质量保证。 

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抗体验证绝非简单的打勾确认

科学研究的可重复性危机凸显了对提高实验试剂质量控制的迫切需求。 

“正如单一实验永远不足以‘证明’某个假设，单项测试也无法确认抗体的有效性，”Crosby 总结道，“通过采用应用导向的验证策略、开展多重实验验证，并参考现有文献和公开数据库，我们能够降低错误发现风险，提高研究结果的可信度。”

在 CST，我们以严格的抗体验证方法而闻名，对此我们深感自豪。当您使用我们的任一试剂时，请相信我们已对其进行了我们能想到的所有测试。正交验证方法仅是我们全线产品所采用的“抗体验证标志”框架中的一个组成部分。

这种级别的验证需要投入大量时间和资源，但我们坚信可靠的试剂具有无可替代的价值。正因如此，尽管自 1999 年成立以来一直是抗体行业的先驱企业，我们的产品目录始终保持着精简规模——仅包含 13,000 余种试剂，远低于其他厂商 100,000+ 的产品数量。这种对质量而非数量的执着追求，使我们能够持续保持性能、可重复性和科学严谨性的最高标准——让研究人员能将更多时间投入科学发现，而非耗在问题排查上。

详细了解 CST 的抗体验证：

阅读我们的“抗体验证标志”系列中的其他博客文章：

• 抗体验证标记简介
• 抗体验证标记：二元战略
• 验证标记：范围策略
• 验证标记：正交策略
• 验证标志：多种抗体策略
• 验证标志：异源策略
• 验证的标志：补充策略

选择以下参考文献

1. Uhlen, M., Bandrowski, A., Carr, S. et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Methods 13, 823–827 (2016). https://doi.org/10.1038/nmeth.3995
2. Mairaville C, Martineau P. Antibody Identification for Antigen Detection in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Using Phage Display and Naïve Libraries. Antibodies (Basel). 2021;10(1):4. Published 2021 Jan 14. doi:10.3390/antib10010004

该博文的最初版本发布于 2020 年 3 月。于 2025 年 4 月更新。25-BRE-03350