蛋白质组学是对蛋白质进行大规模分析，已成为识别和表征新药物靶点的日益重要的工具，因为它提供了了解疾病机制、发现新生物标志物和分析药物药理学的强大方法。PTMScan® 是由 CST 科学家开发的一种基于免疫亲和性的方法，用于识别和定量具有翻译后修饰 (PTM) 的肽，该方法采用 PTM 特异性抗体和液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS)。
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与任何质谱实验一样，保持蛋白质组实验之间的一致性对于确保可比较的结果至关重要。从样品处理的一致性到亲和性能，再到仪器灵敏度，有多种因素会影响结果，特别是当实验间隔数周或数月进行时。确保可重复性可以提高您统计评估不同条件下 PTM 位点丰度变化的能力，而无需诉诸不合理的巨大样本数量和重复样本。
为了帮助科学家更轻松地确保蛋白质组学实验的可重复性，我们创建了一类肽段标准品，可用于监控 PTMScan 富集的效率和一致性：PTMScan 对照肽。这些标准品是基于天然产生的胰蛋白酶序列的合成肽。关键特征是在肽合成期间使用“重”赖氨酸（13C6 15N2-赖氨酸）或精氨酸（13C6 15N4-精氨酸）氨基酸。这些重链形式的肽很容易与内源性轻链形式区分开，它们由于重链赖氨酸和精氨酸氨基酸的掺入而存在固有的质量差异。这可以在图 1 中看到，该图显示了泛素残留抗体对照肽的重肽与轻肽的提取离子色谱图。值得注意的是，并非每种细胞或组织类型都会内源表达给定的修饰肽序列，但此种样品仍然适合内标重质对照肽。
图 1. 使用 PTMScan HS Ubiquitin/SUMO Remnant Motif Kit #59322 富集小鼠肝脏的胰蛋白酶解产物后，将 PTMScan Control Peptides Ubiquitin/SUMO #75964（蓝色）加入样品中，得到其提取离子色谱图 (EIC)。由于所用重同位素的质量差异，重质对照肽可轻易从小鼠肝脏样品中的共洗脱内源性轻修饰肽（黑色）中区分出来。使用 PTMScan 试剂盒鉴定小鼠肝脏样品中的内源性修饰肽（图 1B）不会受到加入 PTMScan 对照肽的影响。
如何在 PTMScan 发现实验中使用对照肽
每个肽对照混合物至少含有三种重肽，这些肽是针对相应 PTMScan 试剂盒特有的，并且已经在对照材料中进行了广泛测试，以确保它们在各种条件下都能被 PTMScan 试剂一致富集。每种混合物中的对照肽都是根据它们的洗脱时间来选择的，以便跨越色谱梯度和其电离特性，从而确保足够的信噪比。
为了使用对照混合物，在进行相应的 PTMScan 富集之前，将等份的对照肽混合物掺入实验样品中。每个对照肽混合物都含有足够的肽，可进行 10 次 PTMScan 实验。
如图 1 所示，在亲和富集和质谱分析之后，由于每个对照肽具有独特的质荷比，因而可以通过提取离子色谱 (EIC) 与其可能存在的内源形式区分开来。
每个试剂盒都指定了对照混合物的计算单质子化前体质量 (MH+) 以及对照肽混合物中每个重肽的相应推荐质荷测量值 (m/z)，以简化鉴定和定量。使用此信息，您可以轻松比较观察到的和计算出的对照肽前体测量值 (m/z)，以评估仪器的质量准确度，从而能够调整数据库搜索和 PTM 肽鉴定的质量准确度容差。每种对照肽组分的注释串联质谱 (MS/MS) 也针对每种混合物进行了指定，如图 2 所示。这可用于将观察到的 MS/MS 与提供的 MS/MS 进行比较，以评估碎片参数是否提供足够的离子灵敏度和覆盖范围来识别和定位 PTM 位点。
图 2. PTMScan Control Peptides Ubiquitin/SUMO #75964 组分的注释串联质谱 (MS2)：TITLEVEPSDTIENVK(gg)A[K]。
我们的广泛测试表明，按照推荐水平添加这些对照肽不会对内源 PTM 肽的富集效率或回收率产生负面影响。使用曲线下面积 (AUC) 测量，可以量化每种肽的丰度并在多个实验中进行比较，从而提供有关富集效率和可重复性的关键信息。此外，由于 PTMScan 试剂具有高度特异性，因此可以对一个样品采用连续富集策略进行实验，并且可以在每个单独的富集步骤中使用对照肽来监测结果。
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图 3. 使用 1mg 人 HEK293 样品肽在三个独立的 PTMScan HS 泛素实验中回收 KGG 对照肽。数据在 ThermoFisher Fusion Lumos 上进行分析。
值得注意的是，无论所研究的物种如何，都可以使用对照肽混合物。使用精确的质量仪器，独特的质荷比与洗脱时间相结合，使研究人员能够在任何 PTMScan 实验中识别这些肽。当在其他物种的样品中使用对照肽时，务必要注意，由于其他物种中蛋白质的序列变异，可能不存在内源信号。
总体而言，这些对照肽可作为外部对照，可实时用于帮助评估各种 PTMScan 实验的亲和富集和肽脱盐步骤的可重复性。
PTMScan 对照肽
CST 为许多可用的 PTMScan 富集试剂盒提供对照肽，我们强烈建议您在下一次 PTMScan 实验中使用相关的对照肽。请参阅下表了解产品列表，每种产品都与 PTM 富集工作流程兼容，包括基于琼脂糖和磁珠的形式。
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