Trim-Away：快速、简单和特定的蛋白质降解

研究活体模型中蛋白质功能的基本方法——基因编辑和 RNA 干扰 (RNAi)——可能会导致意外的非特异性缺陷，从而导致表型受损或难以在某些细胞系中实施。然而，蛋白质降解并不一定很复杂。无需更改您的实验室设置或投资新的培训或设备，即可更快、更轻松地敲低蛋白质。

在这篇博客中，我们回顾了一种基于抗体的蛋白质敲低方法，称为 Trim-Away¹，它可以帮助加快您的研究。这种蛋白质降解方法可以应用于任何内源性蛋白质，无需事先修饰，使用广泛可用的抗体，并且可以在广泛的细胞类型上进行。

Trim-Away 方法如何起作用？

凭借细胞现有的蛋白质降解机制和抗病毒反应，Trim-Away 技术利用靶标特异性抗体在几分钟内即可敲低未修饰的天然蛋白质。这个过程中的关键成分是细胞内 E3 泛素连接酶 TRIM21，它与抗体的 Fc 区结合并被泛素化到被蛋白酶体降解的程度，连同结合的抗体及其特定靶标。通过利用现有的细胞过程，该技术最大限度地降低了非特异性缺陷积累的风险并保留了细胞表型。

图 1：Trim-Away 过程示意图。抗体进入细胞后，通过 Fc 区的表位和 TRIM21 与其靶标结合。这会诱导蛋白酶体中抗体-靶标-TRIM21 复合体的泛素化和降解。

Trim-Away 用于蛋白质敲低的优势

与现有的蛋白质敲低方法相比，Trim-Away 技术具有多项关键优势，使其成为一种最合适的研究工具，只需很少的时间投入即可在实验室中建立。该方法在处理 DNA 敲低或基于 RNA 的敲低方法使用受限或不起作用的模型系统时特别有用，例如处理原代细胞、卵母细胞和缓慢增殖的细胞。

Trim-Away 的优势：

• 高度特异性
• 能够靶向转录后修饰
• 无需基因修饰
• 设置简单，无需额外的技术专长
• 易于验证
• 快速获得结果
• TRIM21 没有看家功能，因此不会破坏正常的细胞功能

考虑到这一点，以前不可靶向的长寿蛋白质现在是敲低实验的主要靶标。这种新兴方法已经显示出其在发育生物学、组织工程、免疫学和靶标发现方面的潜力，已成功用于敲低牛、鼠和人类胚胎中的目的靶标²。此外，已经表明，这种方法有可能在不改变总蛋白质水平的情况下耗尽目标的特定翻译后修饰¹。

使用 Trim-Away 的设置相对简单，实验可以在同一天进行，因为几分钟内就会成功耗尽。以下是计划实验时要牢记的一些准则。

抗体选择标准

要在您的细胞中使用 Trim-Away 实现有针对性的特异性敲低，您需要一种高特异性抗体，它只会与目的靶标结合。最有可能成功的抗体是经过免疫沉淀验证的抗体，因为它们可以识别蛋白质的天然结构，这是该方法最重要的要求。抗体必须采用不含甘油、BSA 和叠氮化物的制剂，因为其他化学物质会影响细胞活力并干扰通路的激活。

几乎 Cell Signaling Technology (CST) 的所有单克隆抗体都以兼容的无载体蛋白制剂形式提供，既可以随时直接发货，也可以作为定制产品。CST 根据 Hallmarks of Antibody Validation™ 严格验证每种抗体，以确保抗体在任何给定测定中的功能、特异性和灵敏度。

合适的转染方法

电穿孔和显微注射是进行转染的两种最常用方法。显微注射在胚胎中更有效，电穿孔则在细胞系中效果更好。除此之外，一些研究实验室还能够使用经典的化学转染方法 优化并使该技术发挥作用^3,4。

测量模型系统中的 TRIM21 水平

在开始之前，我们建议您检查模型系统中的 TRIM21 水平。您可以使用特定的表达数据库（例如人类蛋白质图谱和 BioGPS），或者可以执行快速 qPCR/蛋白质印迹法(WB) 实验。

如果您的特定细胞类型是少数不能产生足够内源性 TRIM21 的细胞类型之一，则可以将重组 TRIM21 添加到含有抗体的转染混合物中，以便一起内化。

验证最终结果

要确认靶标蛋白敲低成功，您可以执行蛋白质印迹法。在您的实验室中设置 Trim-Away 方法的第一个直接实验是使用 GFP 细胞系并用抗 GFP 抗体耗尽它，这样您就可以使用荧光显微镜实时观察降解过程。

选择参考文献：

1. Clift D, So C, McEwan WA, James LC, Schuh M. Acute and rapid degradation of endogenous proteins by Trim-Away. [published correction appears in Nat Protoc. 2018 Nov 30;:]. Nat Protoc. 2018;13(10):2149-2175. doi:10.1038/s41596-018-0028-3. 
2. Gerri C, McCarthy A, Alanis-Lobato G, et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 2020;587(7834):443-447. doi:10.1038/s41586-020-2759-x
3. Clift D, McEwan WA, Labzin LI, et al. A Method for the Acute and Rapid Degradation of Endogenous Proteins. Cell. 2017;171(7). doi:10.1016/j.cell.2017.10.033
4. Weir E, McLinden G, Alfandari D, Cousin H. Trim-Away mediated knock down uncovers a new function for Lbh during gastrulation of Xenopus laevis. Developmental Biology. 2021;470:74-83. doi:10.1016/j.ydbio.2020.10.014