500 抗体和计数：利用经过 Simple Western 技术验证的 CST 抗体加速发现

自 2022 年以来，Cell Signaling Technology (CST) 和 Bio-Techne 一直携手合作，将一流的 CST 抗体带给 ProteinSimple（Bio-Techne 旗下品牌）开发的自动化 Simple Western™ 平台，例如 Jess™ 仪器。现在，超过 500 种 CST^® 抗体已经通过了 Simple Western 平台的验证，凭借无与伦比的自动化和高通量能力推动创新，帮助您更快、更可靠地获得实验结果。

我们广泛的产品组合包括许多独特的、修饰特异性抗体，以支持诸如定向蛋白质降解、CAR-T 信号转导和神经退行性疾病等关键领域的研究，并且还在不断测试和批准更多的抗体。使用我们预先验证的抗体以及建议的抗体稀释条件，可以帮助您降低关键研究项目的风险，实现可靠、可重复结果，即便采用有限或珍贵的样品也是如此。

CST 资深产品科学家 Chris LaBreck 和 Jess。Chris 是本博客的作者，并在设计和实施筛选流程以验证 CST 抗体在 Simple Western 仪器上的有效性方面发挥了关键作用。他直接参与测试和批准所有试剂。 

随着您规划下一个项目，您可能想知道：CST 抗体如何在 Simple Western 平台进行验证？在这篇博客中，我们以一项验证活动为例，展示了每种抗体所接受的全面测试，提供了您所需的详细信息，帮助确保抗体的性能，增强您对抗体效果的信心。

CST 抗体如何在 Simple Western 平台进行验证？

所有 CST 抗体在每项应用中都独立接受严格验证，以确保特异性和可重复性，这就是我公司抗体为何年年成为被引次数最高研究试剂的原因。我们对 Simple Western 仪器的验证也采取同样的严谨方法，现在可以自信地保证 500 多种 CST 抗体在 Simple Western 工作流程中的性能。此外，还有更多经过客户测试的抗体，已在 Bio-Techne 的 Simple Western 抗体数据库中列出。

我们与 ProteinSimple 合作，共同开发并实施了一个筛选流程，用于测试抗体在五个主要关注领域的表现，以下将描述这些领域，并在图 1 中展示相应的示例。使用跨 25 倍稀释范围的三点抗体滴定法验证抗体，并针对宽范围样品浓度测试。在 Jess 仪器上实施测试，并使用 Simple Western 的 Compass™ 软件加以分析。

要认定某抗体已在 Simple Western 平台上通过验证，它必须满足以下标准：

1. 靶标特异性： 特异性峰值必须与相同的样品浓度重叠。
2. 信号/噪声： 信噪比 (S/N) 必须大于或等于 20，并且峰值信号不得饱和。
3. 峰高： 峰高必须介于 1,000 与 300,000 之间。
4. 基线：基线必须小于峰高的 20% 且低于 10,000 阈值。
5. 对照：一抗和 Jess 内标之间或样品和二抗之间不应发生交叉反应，具体表现为没有额外的峰值出现。

综上所述，这些标准可以确认抗体在 Simple Western 仪器上的表现，并帮助我们确定和推荐抗体浓度的稀释范围，在这个范围内抗体浓度达到饱和，从而获得更一致、更可重复的结果。 

让我们更加仔细地看看我们对 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb #4060 进行的部分验证测试结果，如图 1 所示（注：图中红色数字对应于标准数字）。该图显示了在三种不同稀释度下，抗体在泳道视图（左图）和电泳图分析（右图）中的表现。在这个示例中，抗体 #4060 在 1:10 与 1:50 稀释度之间达到饱和，该稀释度是这种抗体的推荐浓度（图 1 中标记为“6”）。

图 1.对 #4060 的 Simple Western 验证测试。左图：Simple Western 虚拟泳道视图。每种抗体在 1:10（蓝色）、1:50（绿色）和 1:250（灰色）稀释度下，与低浓度和高浓度的样本进行测试。右图：三点抗体滴定法电泳图分析。CST 抗体通过分析来自三点抗体滴定法测试的电泳图数据，评估其在 Simple Western 平台上的表现，测试涵盖了广泛的样本浓度范围。

图 1 显示 #4060 满足上文标准列表中所述全部标准，如下文总结：

1. 所有三个稀释度均在预期的分子量处显示出重叠峰。
2. 在建议抗体稀释度的 S/N （蓝色曲线和绿色曲线）为 5,613 或更高。
3. 在建议抗体稀释度的峰高（蓝色曲线和绿色曲线）为小于 100,000 且大于 140,000，这落在可接受范围内。
4. 基线远低于 10,000，且不到总峰高的 20%。
5. 不存在额外峰值表明交叉反应性可忽略。额外峰值将显示为图 1（右图）中的青绿色曲线和洋红色曲线；在这个示例中，洋红色曲线在 #5 标签附近的基线处扁平。

对于每种抗体，我们选择已知显示靶标阳性表达的模型用于我们的测试。靶标表达基于组学数据确定，并使用内部正交方法独立地验证。对于 #4060，我们使用经花萼海绵诱癌素 A (CalA) 处理的 Jurkat 细胞，因为 Jurkat 细胞天然表达 Akt，而 CalA 处理进一步增强其磷酸化形式检出，这使其成为研究磷酰-Akt 表达调控的有用模型。

完成验证测试后，只有当数据符合我们的质量标准时，我们才会批准该抗体用于 Simple Western。对于每种批准的抗体，我们推荐的启动您测定法的稀释浓度范围可在产品网页上的相关产品数据表中找到。

使用 Simple Western 和抗 CAR 接头抗体检测低丰度蛋白质

Simple Western 采用毛细管电泳技术，随后结合共价固定样本蛋白和进行免疫检测，在高度受控的环境下进行蛋白检测。这种方法实现了皮克级的灵敏度，并确保低丰度蛋白的准确定量。Simple Western 的灵敏度卓越而且控制精准，您可以检测到那些传统蛋白质印迹法因灵敏度或特异性不足而无法可靠检测的低丰度蛋白。我们的 CAR-T 接头抗体就是这种情况。

我们的新型抗 CAR 接头抗体专门设计用于在流式细胞术测定法中检测广泛种类的基于 scFv 的 CAR。这些包括我们的 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb #57710 和 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb #71645，这些抗体提供多种偶联形式，并采用不含 BSA 和叠氮化物的制剂。

我们的 Whitlow/218 Linker 未通过传统蛋白质印迹法的验证测试，因此最初仅限于在流式细胞术中使用。然而，该抗体在 Simple Western 仪器上表现出色，首次实现了 CAR-T 细胞信号转导动力学的精确检测和定量表征（图2）。

图 2. 使用 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb #57710，对亲代 Jurkat 细胞和经工程化以表达含 Whitlow/218 接头的基于 scFv 的抗 CD19 CAR (Jurkat/CD19 CAR) 的 Jurkat 细胞的裂解物进行 Simple Western 分析。虚拟泳道视图（左图）显示在一抗稀释度 1:10 时的靶标条带（如所示）。相应的电泳图视图（右图）绘制了在亲代 Jurkat 细胞（黑线）和经工程化以表达含 Whitlow/218 接头的基于 scFv 的抗 CD19 CAR（Jurkat/CD19 CAR）（红线）的 Jurkat 细胞中，一抗 1:10 稀释度时沿毛细管按分子量的化学发光。在制备自两种细胞系的裂解物中，在 134 kDa 处观察到一个非特异性峰。该实验在 Jess 上还原条件下进行，采用 12-230 kDa 分离模块。

这是一个真正令人兴奋的例子，展示了将 CST 抗体应用于 Simple Western 如何帮助解决传统蛋白质印迹法的局限性。Simple Western 为低丰度蛋白质提供更高的灵敏度、精确定量诸如磷酸化等修饰及更清晰的信号，而背景噪声更低。此外，Simple Western 降低的样品要求使得研究有限样品成为可能，例如患者源 CAR-T 细胞或神经元细胞群，从而克服传统蛋白质印迹法中变异性难题和灵敏度难题。

Simple Western：比传统蛋白质印迹法更快速、自动化的替代方法

不熟悉 Simple Western？相对于传统的蛋白质印迹法，Simple Western 仪器提供一种更快速、自动化且定量的替代方法。使用毛细管电泳技术，它能够在不到三小时内分离蛋白质和进行超灵敏的皮克级免疫检测，从而显著减少手动步骤和错误。

传统蛋白质印迹法是一个耗时过程，它往往耗时多日并需要几个手动步骤，从而增加实验错误的可能性。此外，使用传统蛋白质印迹法时，基于化学发光的检测是非定量的，这进一步限制准确度。Simple Western 提供更精确、更可重复的结果，仅需要少至 3 µL 样品。

传统蛋白质印迹法中使用的 CST 抗体轻松适应于 Simple Western 系统，CST 抗体在超过四分之一的 Simple Western 相关出版物中被引用。通过与 ProteinSimple 的合作，我们现在可以保证我们一流的抗体在自动化 Simple Western 工作流程中的表现。我们为特定目的设计的验证流程，通过提供理想的抗体稀释度范围，简化了测定法开发，成为更多专业化 Simple Western 应用的起点。

您可以信赖用于自身 Simple Western 实验的抗体

对 Simple Western 验证过的 CST 抗体实现高通量、可重复检出低丰度蛋白质、生物标记物和瞬时翻译后修饰，这对于诸如药物发现、个性化医疗和研究临床样品有限的疾病等应用至关重要。它的灵敏度和自动化使自身对于分析小量或珍贵患者样品特别有价值，同时确保实验结果的一致性。

我们广泛的产品组合包含超过 500 种对自动化 Simple Western 平台验证过的 CST 抗体，帮助您克服传统蛋白质印迹法的局限性。适合目的的验证过程使得在诸如 Jess 等 Simple Western 平台上更快、更灵敏、更可重复的检测开发成为可能，从而为推进科学发现提供强有力工具。

其他资源

• 阅读 Bio-Techne 客座博客贴文引入对 Simple Western 验证过的 CST 抗体——自动化毛细管电泳免疫分析
• 在以下博客贴文中更多了解我们的新型抗 CAR 接头抗体：用经流式细胞术验证的抗 CAR 接头抗体更快检测 CAR-T 细胞