500 抗体和计数：利用经过 Simple Western 技术验证的 CST 抗体加速发现

自 2022 年以来，Cell Signaling Technology (CST) 和 Bio-Techne 一直携手合作，将一流的 CST 抗体带给 ProteinSimple（Bio-Techne 旗下品牌）开发的自动化 Simple Western™ 平台，例如 Jess™ 仪器。现在，超过 500 种 CST^® 抗体已经对 Simple Western 平台验证过，从而以无与伦比的自动化和让您能够实现更快、更可靠结果的高通量能力推动创新。

我们广泛的产品组合包括许多独特的、修饰特异性抗体，以支持诸如定向蛋白质降解、CAR-T 信号转导和神经退行性疾病等关键领域的研究，并且一直受到测试及批准。使用我们预先验证的抗体以及建议的抗体稀释条件，可以帮助您降低关键研究项目的风险，实现可靠、可重复结果，即便采用有限或珍贵的样品也是如此。

CST 资深产品科学家 Chris LaBreck 和 Jess。Chris 是本博本的作者，对设计并实施在 Simple Western 仪器上验证 CST 抗体的筛选流程至关重要。他直接参与测试和批准所有试剂。 

随着您规划下一个项目，您可能想知道：CST 抗体如何针对 Simple Western 平台受到验证？在这篇博本中，我们突出一项验证活动作为每种抗体所接受全面测试的示例，从而给予您对抗体性能有信心所需的细节。

CST 抗体如何针对 Simple Western 受到验证？

所有 CST 抗体在每项应用中都独立接受严格验证，以确保特异性和可重复性，这就是我公司抗体为何年年成为被引次数最高研究试剂的原因。我们对 Simple Western 仪器的验证也采取同样的严谨方法，现在可以自信保证 500 多种 CST 抗体在 Simple Western 工作流程中的性能，这些抗体不包括在Bio-Techne 的 Simple Western 抗体数据库中主打的客户测试额外抗体。

我们与 ProteinSimple 合作，共同开发并实施了一个在五大目的领域测试抗体性能的筛选流程，这些领域描述如下并且在1 中所示的示例中演示。使用跨 25 倍稀释范围的三点抗体滴定法验证抗体，并针对宽范围样品浓度测试。在 Jess 仪器上实施测试，并使用 Simple Western 的 Compass™ 软件加以分析。

要认定某抗体对于 Simple Western 验证通过，它必须满足以下标准：

1. 靶标特异性： 特异性峰值必须与相同的样品浓度重叠。
2. 信号/噪声： 信噪比 (S/N) 必须大于或等于 20，并且峰值信号不得饱和。
3. 峰高： 峰高必须介于 1,000 与 300,000 之间。
4. 基线：基线必须小于峰高的 20% 且低于 10,000 阈值。
5. 对照：一抗和 Jess 内标之间或样品和二抗之间不应发生交叉反应，这通过不存在额外峰所展示。

综合一起，这些标准可以确认抗体在 Simple Western 仪器上的性能，并允许我们确定并推荐抗体浓度正在饱和的稀释范围，从而获得更一致、更可重复的结果。 

让我们细看来自我们验证测试 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP^® Rabbit mAb #4060 的一些结果，如图 1 所示（注：图中红色数字对应于标准数字）。该图显示三种不同稀释度时泳道视图（左图）和电泳图分析（右图）中的抗体性能。在这个示例中，抗体 #4060 在 1:10 与 1:50 稀释度之间达到饱和，该稀释度是这种抗体的推荐浓度（图 1 中标记为“6”）。

图 1.对 #4060 的 Simple Western 验证测试。左图：Simple Western 虚拟泳道视图。每种抗体按 1:10（蓝色）、1:50（绿色）和 1:250（灰色）稀释度针对样品低浓度和高浓度受测。右图：三点抗体滴定法电泳图分析。通过检查来自跨宽大范围样品浓度三点抗体滴定法的电泳图数据评估 CST 抗体的 Simple Western 性能。

图 1 显示 #4060 满足上文标准列表中所述全部标准，如下文总结：

1. 所有三个稀释度均在预期的分子量处显示出重叠峰。
2. 在建议抗体稀释度的 S/N （蓝色曲线和绿色曲线）为 5,613 或更高。
3. 在建议抗体稀释度的峰高（蓝色曲线和绿色曲线）为小于 100,000 且大于 140,000，这落在可接受范围内。
4. 基线远低于 10,000，且不到总峰高的 20%。
5. 不存在额外峰值表明交叉反应性可忽略。额外峰值将显示为图 1（右图）中的青绿色曲线和洋红色曲线；在这个示例中，洋红色曲线在 #5 标签附近的基线处扁平。

对于每种抗体，我们选择已知显示靶标阳性表达的模型用于我们的测试。靶标表达基于组学数据确定，并使用内部正交方法独立地验证。对于 #4060，我们使用经花萼海绵诱癌素 A (CalA) 处理的 Jurkat 细胞，因为 Jurkat 细胞天然表达 Akt，而 CalA 处理进一步增强其磷酸化形式检出，这使其成为研究磷酰-Akt 表达调控的有用模型。

完成验证测试后，只有数据符合我们的质量标准，我们才批准该抗体用于 Simple Western。对于每种批准的抗体，我们提出来启动您测定法的建议稀释度范围可以在产品网页上的相关产品数据表中找到。

使用 Simple Western 和抗 CAR 接头抗体检测低丰度蛋白质

Simple Western 使用毛细管电泳，随后样品蛋白共价固定和免疫检测，在高度设对照环境下检测蛋白质，这实现皮克级灵敏度并确保准确定量低丰度蛋白质。改进的 Simple Western 灵敏度和对照允许用否则可能因灵敏度或特异性不够而无法借助传统蛋白质印迹法可靠检出低丰度蛋白质的抗体检出相同靶标。对于我们的 CAR-T 接头抗体就是这种情况。

我们的新型抗 CAR 接头抗体专门设计成在流式细胞术测定法中检测广泛类型基于 scFv 的 CAR。这些抗体包括我们的 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb #57710 和 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb #71645，它们配合各自偶联及在不含 BSA 且不含叠氮化物的制剂中提供。

我们的 Whitlow/218 Linker 未通过传统蛋白质印迹法的验证测试，因此最初限定其拥有流式细胞术。然而，该抗体在 Simple Western 仪器上表现了出乎意料的性能，首次实现精确检测及定量表征 CAR-T 细胞信号转导动力学（图2）。

图 2. 使用 Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb #57710，对亲代 Jurkat 细胞和经工程化以表达含 Whitlow/218 接头的基于 scFv 的抗 CD19 CAR (Jurkat/CD19 CAR) 的 Jurkat 细胞的裂解物进行 Simple Western 分析。虚拟泳道视图（左图）显示在一抗稀释度 1:10 时的靶标条带（如所示）。相应的电泳图视图（右图）绘制了在亲代 Jurkat 细胞（黑线）和经工程化以表达含 Whitlow/218 接头的基于 scFv 的抗 CD19 CAR（Jurkat/CD19 CAR）（红线）的 Jurkat 细胞中，一抗 1:10 稀释度时沿毛细管按分子量的化学发光。在制备自两种细胞系的裂解物中，在 134 kDa 处观察到一个非特异性峰。该实验在 Jess 上还原条件下进行，采用 12-230 kDa 分离模块。

这是一个把 CST 抗体带给 Simple Western 如何有助解决传统蛋白质印迹法局限性的令人非常兴奋示例。Simple Western 为低丰度蛋白质提供更高的灵敏度、精确定量诸如磷酸化等修饰及更清晰的信号，而背景噪声更低。此外，Simple Western 降低的样品要求使得研究有限样品成为可能，例如患者源 CAR-T 细胞或神经元细胞群，从而克服传统蛋白质印迹法中变异性难题和灵敏度难题。

Simple Western：比传统蛋白质印迹法更快、可自动化的替代

不熟悉 Simple Western？相对于传统的蛋白质印迹法，Simple Western 仪器提供一种更快、可自动化和定量性替代。使用毛细管电泳，允许在不到三个小时内分离蛋白质和进行超灵敏、皮克级免疫检测，从而显著减少手动步骤和错误。

传统蛋白质印迹法是一个耗时过程，它往往耗时多日并需要几个手动步骤，从而增加实验错误的可能性。此外，使用传统蛋白质印迹法时，基于化学发光的检测是非定量的，这进一步限制准确度。Simple Western 提供更精确、更可重复的结果，仅需要少至 3 µL 样品。

传统蛋白质印迹法中使用的 CST 抗体轻松适应于 Simple Western 系统，CST 抗体在超过四分之一的 Simple Western 相关出版物中被引用。通过与 ProteinSimple 的合作，我们现在可以保证我公司一流抗体在自动化 Simple Western 工作流程中的性能。通过提供理想的抗体稀释度范围用作更专门化 Simple Western 应用的起点，我们适合目的的验证简化了测定法开发。

您可以信赖用于自身 Simple Western 实验的抗体

对 Simple Western 验证过的 CST 抗体实现高通量、可重复检出低丰度蛋白质、生物标记物和瞬时翻译后修饰，这对于诸如药物发现、个性化医疗和研究临床样品有限的疾病等应用至关重要。它的灵敏度和自动化使自身对于分析小量或珍贵患者样品特别有价值，同时确保结果跨各实验一致。

我们广泛的产品组合包含超过 500 种对自动化 Simple Western 平台验证过的 CST 抗体，帮助您克服传统蛋白质印迹法的局限性。适合目的的验证过程使得在诸如 Jess 等 Simple Western 平台上更快、更灵敏、更可重复的检测开发成为可能，从而为推进科学发现提供强有力工具。

其他资源

• 阅读 Bio-Techne 客座博客贴文引入对 Simple Western 验证过的 CST 抗体——自动化毛细管电泳免疫分析
• 在以下博客贴文中更多了解我们的新型抗 CAR 接头抗体：用经流式细胞术验证的抗 CAR 接头抗体更快检测 CAR-T 细胞