直接法和间接法多重免疫荧光技术 (mIF) 为在不依赖专业仪器的情况下探索空间生物学提供了简便途径。通过在同一样本中组合使用多种抗体，您可以快速可视化细胞类型、亚细胞结构及功能状态，从而描绘不同蛋白质在组织内的共定位关系，并揭示这种组织结构与疾病生物学的关联。
许多低多重指数的免疫荧光实验采用两种方法：使用二抗的间接检测法，或使用荧光团偶联一抗的直接检测法。根据实验设计，这些方法可应用于多种方式制备的细胞或组织样本。两种方法均适用于常规免疫荧光工作流程和标准宽场或共聚焦显微镜，但在方案设计、样本类型选择以及与更高多重指数平台的未来兼容性方面，各有其优势与局限。
本文将介绍在同一次检测中运用多抗体进行荧光染色的两种实用技术，并阐释新型工具（如嵌合抗体和 SignalStar® 多重 IHC 检测）如何将荧光多重检测技术提升至全新的高度。
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基于宿主种属的多重间接免疫荧光技术
在设计针对同一样本中 3-4 种靶标蛋白的低多重指数免疫荧光实验时，基于宿主种属的多重检测是标准方法。该方法中，每种一抗源自不同宿主物种（例如兔源和鼠源），随后使用偶联不同荧光团的种属特异性二抗进行检测。由于荧光信号源自二抗而非一抗，因此被称为间接检测法。
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基于宿主种属的多重间接免疫荧光技术在细胞、冷冻组织和石蜡包埋组织（IHC-石蜡）中的应用。左图：使用 LC3B (E5Q2K) Mouse Monoclonal Antibody #83506（绿色）、beta-Actin (13E5) Rabbit Monoclonal Antibody #4970 和 DAPI #4083（蓝色）对经过 Chloroquine #14774（50 µM，过夜）处理的 HCT 116 细胞进行分析。
中图：使用 β3-Tubulin (D71G9) Horse Chimeric Monoclonal Antibody #59820（绿色）、Iba1/AIF-1 (E4O4W) Feline Chimeric Monoclonal Antibody #87276（灰色）、GFAP (E4L7M) Rabbit Monoclonal Antibody #80788（红色）和 DAPI #4083（蓝色）对固定冷冻的小鼠小脑组织进行分析。其中兔源一抗使用抗兔 Fc 特异性二抗检测。
右图：使用 KI-67 (D3B5) Feline Chimeric Monoclonal Antibody #43021（绿色）、beta-Catenin Mouse Chimeric Monoclonal Antibody（黄色）、Vimentin (D21H3) Rabbit Monoclonal Antibody #5741（红色）和 DAPI #4083（蓝色）对石蜡包埋的人鳞状细胞肺癌组织进行分析。其中兔源一抗使用抗兔 Fc 特异性二抗检测。
为何使用基于宿主种属的多重检测？
基于宿主种属的多重检测主要优势在于，相比大多数直接免疫荧光方法，它能提供更明亮的信号——这是因为每个一抗可通过二抗结合多个荧光团，从而实现信号放大。该方法还为实验设计增添了一定的灵活性，您可以自由选择将特定荧光团与特定一抗配对。其代价是需要高质量的二抗以避免交叉反应和背景信号，并且需要增加二抗孵育步骤。
基于宿主种属的间接免疫荧光是进入多重成像领域的绝佳切入点，适用于培养细胞、固定冷冻组织切片和多种 FFPE 组织样本，特别是在您希望使用实验室现有荧光显微镜可视化 2-4 种标记物时尤为合适。以此方式构建的检测方案，通常与采用二抗或类似间接检测方法的高内涵多重空间生物学平台在概念上兼容。这为您后续在 Lunaphore COMET 系统或其他循环免疫荧光平台等设备上，进一步拓展生物学研究提供了便利。
使用嵌合抗体拓展基于宿主种属的多重检测
从历史上看，基于宿主种属的多重检测一直受限于非兔源一抗的可及性和质量。CST 嵌合抗体通过将经过充分验证的兔单克隆抗体的结合域移植到不同宿主的骨架上，帮助解决了这一局限。每种嵌合抗体都保持与原兔源克隆相同的特异性，但现在可用不同的种属特异性二抗进行检测，从而在同一次实验中解锁更多检测通道。
由于 CST 嵌合抗体设计用于标准免疫荧光和免疫组织化学工作流程，并经验证适用于固定冷冻组织和 FFPE 组织，因此您可以将其添加到现有的基于宿主种属的多重检测方案中，而无需改变您的实验条件或成像设置。这种灵活性使您能够使用经证明具有特异性和灵敏度的抗体构建复杂的检测方案，这对于依赖多重成像技术的神经科学、免疫学及其他领域的研究极具价值。
间接免疫荧光实验步骤概述（基于宿主种属的多重检测）
以下是使用不同宿主物种（例如兔和小鼠）来源的抗体和/或来自其他宿主物种的嵌合抗体进行间接免疫荧光检测的常规流程概述。请注意，根据特定产品的推荐实验步骤，实际实验步骤会有所不同。
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样品制备：对于所有 CST 抗体，请遵循产品网页或说明书中列出的建议实验步骤。可能需要进行一些优化和额外测试。
- 抗原修复（!! 仅限 FFPE 组织 !!）：将玻片浸没于 1X EDTA 修复液中，放入微波炉加热至沸腾；随后在亚沸腾温度 (95°-98°C) 下继续处理 15 分钟。无需冷却。
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润洗：用 1X PBS 短暂润洗玻片。
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封闭：使用封闭液封闭 60 分钟，以避免二抗发生非特异性结合。
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注意：在同一样本中使用多种种属特异性二抗时，此步骤尤为重要。
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稀释并孵育一抗：使用抗体稀释缓冲液将每种一抗稀释至产品网页或说明书中推荐的稀释度；吸干封闭液，然后加入稀释后的一抗。在 4°C 下孵育过夜。
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洗涤：用 1X PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
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稀释并孵育二抗：使用抗体稀释缓冲液将每种荧光素偶联的二抗稀释至产品网页或说明书中推荐的稀释度，然后加入稀释后的二抗。在室温下孵育 1 小时。
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注意：选择种属特异性二抗（例如抗兔 Fc、抗小鼠、抗马、抗猫），并选择与光谱重叠最小的荧光团进行偶联。使用嵌合抗体时，务必使用抗兔 Fc 特异性抗体，而非任何抗兔二抗。
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复染：使用互补试剂（如 DAPI）进行任何复染步骤，然后用抗淬灭封片剂封片。
当您为冷冻组织设计检测方案时，应使用经免疫荧光-冷冻验证并确认在相关物种中有效的抗体，因为其固定和抗原修复要求与 FFPE 组织不同。只要您使用经 FFPE 验证的抗体和适当的抗原修复条件，类似的基于宿主种属的多重检测策略也可适用于 FFPE 组织。
采用荧光团偶联一抗的直接免疫荧光法
直接免疫荧光法使用偶联不同光谱荧光团的一抗进行检测，无需使用二抗。这仍然是一种强大的多重检测策略，尤其适用于 2-3 种标记物，并且可能是开展多重成像研究的一种高效方式。
采用荧光团偶联一抗的直接免疫荧光法在细胞、冷冻组织和石蜡包埋组织（IHC-石蜡）中的应用。左图：使用 β-Catenin (D10A8) Rabbit Monoclonal Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #88187（绿色）、MTHFD2 (E7A4L) Rabbit Monoclonal Antibody (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #64107（红色）和 DAPI #4083（蓝色）对 HeLa 细胞进行分析。
中图：固定冷冻的小鼠结肠组织。在使用 Rabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control #3900 封闭游离的二抗结合位点之前，切片先用 E-Cadherin (24E10) Rabbit Monoclonal Antibody #3195（红色）标记。随后，切片使用 β-Catenin (D10A8) Rabbit Monoclonal Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #88187（绿色）和 DAPI #4083（蓝色）标记。
右图：使用 HLA-DRA (E9R2Q) Rabbit Monoclonal Antibody #97971 (Alexa Fluor® 750 Conjugate)（红色）、CD68 (D4B9C) Rabbit Monoclonal Antibody (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #24850（黄色）、Pan-Keratin (Type I) (E6S1S) Rabbit Monoclonal Antibody (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #75435（绿色）和 DAPI #4083（蓝色）对石蜡包埋的人结肠腺癌组织进行分析。
为何使用直接免疫荧光多重检测？
当您希望简化实验步骤、省去二抗孵育步骤时，直接免疫荧光多重检测是理想选择。这不仅能缩短手动操作时间，还能减少移液错误或二抗交叉反应的风险。通过在同一次实验中使用来自同一宿主物种（通常是兔）的多种抗体，您无需费心选择种属特异性二抗，从而简化了实验方案设计。
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Virginia (Ginny) Bain |
“直接免疫荧光结合荧光标记技术是一种非常强大的工具——它能让您使用来自同一物种的优选抗体进行多重检测，而无需担心交叉反应性问题。 这使您能够以一种新颖、高效的方式，使用那些已被证明成功的抗体。对于实验设计而言，这是一个巧妙又简便的解决方案。” |
由于信号来源于单个荧光团偶联的一抗，直接免疫荧光法产生的信号通常低于间接免疫荧光法，但对于中高表达的靶标而言，其信号强度仍然足够。只要抗体在相关样本类型（固定冷冻组织或 FFPE 组织）中经免疫荧光验证有效，且所选的荧光团与您的滤光片组匹配，直接免疫荧光法就能在标准宽场或共聚焦显微镜上良好运行，并适用于培养细胞和组织切片。根据所用荧光团的不同，这些检测方案也可能与常见的成像平台兼容，例如 Leica Microsystems 的 Cell DIVE 多重成像解决方案。
何时应使用直接免疫荧光法与间接免疫荧光法？
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当您需要对低丰度靶标获得更高灵敏度、希望使用同一批一抗搭配不同二抗，或计划在组织样本上利用嵌合抗体和二抗检测拓展至基于宿主种属的多重检测时，请使用间接法（基于宿主种属）。
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当您的靶标相对丰富、偏好更快速的实验流程、需要避免小鼠样本上的鼠对鼠背景，或希望在同一次实验中组合使用多种兔源抗体时，请使用直接免疫荧光法。
在实践中，许多实验室会结合使用这两种策略——例如，在同一样本中，对弱信号靶标使用间接检测法，而对强信号标记物使用直接标记偶联物——前提是精心规划好荧光团的选择和成像设置。您可以通过这篇博客了解更多关于结合直接与间接免疫荧光法设计复杂检测方案的信息：结合直接与间接多重免疫荧光：偶联抗体的使用策略。
使用偶联不同荧光团的抗体进行直接 IF 的实验步骤
以下是使用直接偶联不同荧光团的一抗进行直接免疫荧光染色的常规流程概述。与常规操作相同，具体建议请参考各产品说明书。
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样品制备：对于所有 CST 抗体，请遵循产品网页或说明书中列出的建议实验步骤。可能需要进行一些优化和额外测试。
- 抗原修复（!! 仅限 FFPE 组织 !!）：将玻片浸没于 1X EDTA 修复液中，放入微波炉加热至沸腾；随后在亚沸腾温度 (95°-98°C) 下继续处理 15 分钟。无需冷却。
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润洗：用 1X PBS 短暂润洗玻片。
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封闭：使用封闭液封闭 60 分钟。
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稀释并孵育：使用抗体稀释缓冲液将每种一抗稀释至产品网页或说明书中推荐的稀释度；吸干封闭液，然后加入稀释后的一抗。在 4°C 下孵育过夜。
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洗涤：用 1X PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
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复染：使用互补试剂（如 DAPI）进行任何复染步骤，然后用抗淬灭封片剂封片。
设计直接免疫荧光检测方案时，应选择激发和发射光谱相互分离且与您的显微镜兼容的荧光团，以避免光谱重叠。CST 提供一系列直接偶联的单克隆抗体，涵盖常用荧光颜色，可轻松组合构建用于基础多重实验的 2-4 色检测方案。
总结：多重空间生物学的后续步骤
间接法和直接法多重免疫荧光是利用现有显微镜和标准工作流程，开始探索多重组织成像和空间生物学的最便捷途径。通过谨慎选择基于宿主种属的间接免疫荧光法、直接免疫荧光法，或两者结合，并在需要更多宿主种属时利用嵌合抗体，您可以在无需专业仪器的情况下，构建能够解答重要生物学问题的低多重指数检测方案。
随着您的研究问题日趋复杂，并希望在 FFPE 组织中检测更多标记物或更低丰度的功能性靶标时，您可能需要从低多重指数免疫荧光技术升级到中等多重指数的空间生物学平台。SignalStar 多重 IHC 检测提供了自然的进阶选择：该技术采用基于寡核苷酸的扩增方法，在 FFPE 切片上同时检测多个表型和功能性标记物，通过两天的非循环工作流程，实现高达 8 重扩增的空间图谱分析。
无论您是在设计首个三色免疫荧光实验，还是计划向更高重数的空间生物学过渡，选择经应用验证的抗体、将其与您的样本类型和成像设备相匹配，并规划好与未来平台的兼容性，都将有助于确保获得可靠且具有生物学意义的数据。CST 关于免疫荧光、嵌合抗体和多重空间生物学的资源，可在每一步为您提供指导——从方案设计和实验步骤优化，到从低重数显微镜技术向 SignalStar 技术等中重数空间平台的跨越，乃至更远的未来。
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