在一次实验中使用多种抗体可为研究人员提供有用的信息。用多种抗体和细胞染料进行共染色是一种简单且低含量形式的多重分析。在细胞和组织中进行多重分析的技术是强大的研究工具，适用于一般细胞生物学研究及诊断目的。这些技术让研究人员能够检测多种生物标记物，以评估其样品。它们还可实现简单的共定位研究，以确定分析物之间的关系。
在这里，我们描述了在同一检测中使用多种抗体进行免疫荧光 (IF) 染色的两种常用技术。
使用不同物种产生的抗体进行间接 IF 的实验步骤。
下面是使用在不同宿主（例如，兔子和小鼠）中产生的抗体，进行间接 IF 的常规流程概述。请注意，根据特定产品的推荐实验步骤，实际实验步骤会有所不同。
- 固定/通透
- 优化实验步骤，以便使用两种抗体时都能获得最佳结果
- 可能需要单独进行测试
- 润洗
- 封闭细胞，以避免二抗非特异性结合
- 如果两种二抗均产自相同物种（即羊），则可获得最佳效率
- 用抗体稀释缓冲液将每种一抗稀释到建议的稀释度；在 4°C 下孵育过夜
- 润洗
- 用抗体稀释缓冲液将每种荧光团偶联二抗稀释到建议的稀释度；在室温下孵育 1 小时
- 二抗偶联荧光团时不得出现光谱重叠
- 任何对比染色步骤均使用补充试剂进行，补充试剂封装在抗褪色试剂中
使用间接 IF 染色方法和在不同宿主中产生的抗体的利弊如下：
优点：
- 相较于使用偶联物进行直接检测亮度更强
- 与标准染色实验步骤类似与标准染色实验步骤类似（甲醛固定的免疫荧光实验步骤）
- 使用常见试剂，无需特殊成像设备
缺点：
- 可用宿主有限
- 需要单独进行二抗孵育步骤
左图：使用经 Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 检测到的 α-Parvin (D7F9) XP® Rabbit mAb #8190（绿色）、经 Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4409 检测到的 Lamin A/C (4C11) Mouse mAb #4777（红色）和 DRAQ5® #4084（伪彩蓝色）对 SNB19 细胞进行染色。
中图：使用经 Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 检测到的 AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318 （绿色）、经 Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4409 检测到的 EpCAM (VU1D9) Mouse mAb #2929（红色）和 DRAQ5® #4084（伪彩蓝色）对 MCF-7 细胞进行染色。
右图：使用经 Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 检测到的 Caveolin-1 (D46G3) XP® Rabbit mAb #3267 （绿色）、经 Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #4409 检测到的 Ki-67 (8D5) Mouse mAb #9449（红色）和 DRAQ5® #4084（伪彩蓝色）对 MCF-7 细胞进行染色。
使用偶联不同荧光团的抗体进行直接 IF 的实验步骤
下面是使用直接偶联不同荧光团的抗体进行直接 IF 染色的常规流程概述。请注意，根据特定产品的推荐实验步骤，实际实验步骤会有所不同。
- 固定/通透
- 优化实验步骤，以便使用两种抗体时都能获得最佳结果
- 可能需要单独进行测试
- 润洗
- 用抗体稀释缓冲液将每种抗体稀释到建议的稀释度；在 4°C 下孵育过夜
- 润洗
- 任何对比染色步骤均使用补充试剂进行，补充试剂封装在抗褪色试剂中
使用直接 IF 染色法和偶联不同荧光团的抗体的利弊如下：
优点：
- 允许对在同一宿主中产生的抗体进行多重分析
- 比间接检测更高效（无二抗检测步骤）
- 类似于标准染色实验步骤（甲醛固定的免疫荧光实验步骤）
- 使用常见试剂，无需特殊成像设备
缺点：
- 亮度上比使用二抗进行的间接检测暗
- 可用荧光团有限
使用 Neurofilament-L (C28E10) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #8024（绿色）、GFAP (GA5) Mouse mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #3656（红色）和 α-Synuclein (D37A6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4639（伪彩蓝色）对成年大鼠海马细胞进行染色。
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