用于 IHC 和 IF 的不同多重分析技术的利弊

多重免疫组织化学 (mIHC) 和多重免疫荧光(mIF) 广泛用于识别和定位组织样本内不同的细胞类型。但是选择正确的技术取决于研究目标和可用工具。最近的文章突出显示了不同的 mIHC/mIF 方法的优缺点，并解释了这些方法有何不同。¹

多重显色 IHC

传统的显色 IHC 使用 DAB 或 AEC 可视化整个玻片上的单个靶标。然而，新的色原底物可以在短短 10-15 小时内同时或按顺序复用三到五个标记物。显色 IHC 的优点包括价格实惠且相对容易操作，以及它利用既定的实验步骤和指南。它还可以轻松实现自动化的高通量应用。缺点包括大多数显色底物具有有限的动态范围（意味着标记强度至多是半定量的）并且只有极少数可以组合用于研究标记共表达。

单个切片上的多重 IHC 连续染色 (MICSSS)

MICSSS 与传统的显色 IHC 相似，但该技术使用迭代循环在整张切片上显示多达 10 个标记物。² 一次检测一个标记物消除了可能会影响结果的空间位阻或相互渗漏的风险。但是，通量有限（每个周期需要 1-2 天才能完成），并且将单个的 MICSSS 图像合并起来进行分析可能会非常困难。

MICSSS 的其他缺点是在循环操作之间去除盖玻片和化学脱色/抗原修复会损坏组织，并且信号强度只是半定量。

多重 IHC 

多重 IF 使用标记有荧光团的抗体同时检测多个标志物。根据实验步骤，这可能需要 2 到 20 小时。标准 IF 显微镜通常允许在单轮染色中对四到五个标记物进行全切片可视化检测。相比之下，多光谱显微镜可用于分析不同目标区域 (ROI) (0.66mm²) 内的多达 8 个标记物，这些标记物随后可进行拼贴。

新兴研究表明，多重 IF 的循环染色方法可以检测 30-60 个标记物。^3,4,5 多重 IF 的主要优势在于，大多数荧光团的线性动态范围较大，可以定量标记物强度。但是，必须谨慎选择荧光基团以防止不同荧光基团间的渗漏，并且在使用酪胺信号放大 (TSA) 增强信号强度的情况下，还需要进行其他检查才能排除使用 TSA 试剂的潜在的封闭作用。

博客：使用多种抗体进行荧光染色：两种常见技术

基于组织的质谱分析

通过使用带有金属标记的一抗，基于组织的质谱分析能够同时显示 40 个或更多标记物，并且在 4°C 下染色 12 小时即可。与多重 IF 相似，它用于分析不同的 (1mm²) ROI，并且可以对标记物强度进行定量测量。这是通过两种主要方法实现的：多重离子束飞行时间成像 (MIBI-TOF) 和成像质谱流式 (IMC)，在 TOF 分析之前，它们使用不同的机制从每个 ROI 生成离子。由于基于组织的质谱避免使用荧光团，因此消除了信号衰减、光谱重叠或自发荧光的风险。与这些优点相悖的是，基于组织的质谱法的主要缺点是仪器极其昂贵且需要大量培训。

数字空间分析 (DSP)

数字空间分析是一种相对较新的技术，它使用结合了紫外线可裂解荧光 DNA 标签的一抗来量化标记物。⁶ 虽然与多光谱显微术和基于组织的质谱分析相比 ROI 较小 (0.28mm²)，但是 DSP 可以检测更多标记物（实际检测 40-50，但理论上多达 800），只需一轮染色，并且需要的时间更短（1 小时）。DSP 的主要局限是它不会生成图像。相反，在将剪切的 DNA 标签转移到多孔板进行分析之前，最多使用 4 种荧光团标记的抗体选择 ROI。

多重实验的抗体选择 

尽管此处介绍的每种技术都有其优点和缺点，但是这些方法中的任何一种的成功都取决于高特异性抗体的使用，所选抗体与样本制备方法相匹配。对于 FFPE 组织，Cell Signaling Technology 提供了经 IF-石蜡或 IHC 验证的抗体目录，而对于冷冻组织，请考虑从经过 IF-冷冻验证的抗体中选择。

由于我们遵守抗体标记验证 - 六种互补策略，可用于在任何给定测定中确认抗体的功能、特异性和敏感性，无论选择哪种方法，您都可以信任我们获得可靠的 mIHC/mIF 结果。

其他资源： 

• 博客：使用多种抗体进行荧光染色：两种常见技术
• 博客：揭开多重 IHC 抗体组合设计的神秘面纱
• 博客：使用偶联抗体成功进行多重免疫荧光实验的策略

参考文献： 

1. Taube JM, Akturk G, Angelo M, et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation [published correction appears in J Immunother Cancer. 2020 Jun;8(1):]. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000155. doi:10.1136/jitc-2019-000155
2. Remark R, Merghoub T, Grabe N, et al. In-depth tissue profiling using multiplexed immunohistochemical consecutive staining on single slide. Sci Immunol. 2016;1(1):aaf6925. doi:10.1126/sciimmunol.aaf6925
3. Goltsev Y, Samusik N, Kennedy-Darling J, et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 2018;174(4):968-981.e15. doi:10.1016/j.cell.2018.07.010
4. Lin JR, Izar B, Wang S, et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. Elife. 2018;7:e31657. Published 2018 Jul 11. doi:10.7554/eLife.31657
5. Gerdes MJ, Sevinsky CJ, Sood A, et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):11982-11987. doi:10.1073/pnas.1300136110
6. Merritt CR, Ong GT, Church SE, et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 2020;38(5):586-599. doi:10.1038/s41587-020-0472-9