小胶质细胞活化抗体工具包：研究 TREM2 信号转导的高内涵方法

选择抗体研究神经退行性疾病的分子信号转导是一个复杂而细致的过程，但它对增进我们理解脑功能和疾病至关重要。本博客探讨了 CST 和 FUJIFILM Cellular Dynamics 之间的一个合作项目，在该项目中，我们使用 iCell Microglia 产品以及一个关键抗体工具包表征神经退行性疾病中的信号转导事件。我们选择的抗体为验证 iPSC 衍生性小胶质细胞 (iMGL) 的身份和功能提供了一种有价值的高内涵方法，尤其在神经炎症背景下。

继续阅读以了解该项目，或使用此链接跳转到我们建议用于研究神经退行性疾病中小胶质细胞活化的经 IF 验证人类反应性抗体列表。您还可以下载以下研究海报，我和同事曾在 2024 年神经科学学会 (SfN) 上展示过它。

利用 iPSC 衍生性小胶质细胞对人神经炎症建模

小胶质细胞是脑常驻性免疫细胞，对理解神经炎症和神经变性至关重要，并且它们在阿尔茨海默病 (AD) 和衰老中的作用也日益得到公认。迄今为止，小鼠模型一直是研究这些有趣细胞的主流方法。然而，尽管小鼠小胶质细胞和人小胶质细胞有诸多相似之处，但出现（尤其衰老过程中）的基因表达关键差异使小鼠模型与转化研究的相关性受到质疑。¹

博客作者 Virginia Bain 博士在 2024 年神经科学学会 (SfN) 上展示了这项研究的成果。 

人诱导多能干细胞 (hiPSC) 可以帮助弥合这个差距，从而使得体外研究如同人小胶质细胞发挥作用的细胞成为可能。我们特别选择 iMGL 来研究神经炎症，因为这些细胞模拟人小胶质细胞行为，使其对表征炎症反应极有用。² 它们兼容于 96 孔板模式使高内涵分析多种蛋白质成为可能，从而能够更全面地了解人小胶质细胞活化。

用于小胶质细胞表征的高内涵免疫荧光法

有许多方法可以表征与疾病相关的小胶质细胞及其对体外刺激的反应。以 96 孔板或 384 孔板模式作业非常适合测量蛋白质水平、代谢功能和形态、还兼顾评估治疗或基因操作影响的测定法。我们选择免疫荧光、尤其高内涵分析 (HCA) 来进行这项工作，因为它能够同时研究治疗引起的蛋白质水平、定位和形态变化。这种方法可以生成大量可按有趣方式可视化以更好了解群体动态的数据。

诱导神经炎症反应

为了诱导炎症，我们采取了两种独立的方法。首先，我们利用脂多糖 (LPS) 处理探索了经典的炎症反应。LPS 处理是文献中公认的炎症诱导方法，对许多类型的免疫细胞有效。 

当然，LPS 在脑中并不常见，尤其在 AD、多发性硬化症 (MS) 和帕金森病 (PD) 等神经炎症疾病中如此。然而，促炎细胞因子天然存在，并且可以在体外系统中引入。我们诱导神经炎症的第二种方法是使用促炎细胞因子 IFNγ 和 TNFα，一种在文献中支持用于大鼠小胶质细胞的方法。³

我们比较了这些不同方法的结果，发现了一些令人惊讶的细胞形态差异。

用于研究神经炎症反应的抗体工具包

1. NF-κB p65

为了确认诱导了炎症，我们用 NF-κB p65 (D14E12) XP^® Rabbit mAb #8242 着染细胞。NF-κB p65 是一种强有力的读出，因为它允许您在应答的细胞中测量胞浆至胞核的运输。这是一种经典的 HCA 方法，因为可以清楚地定义什么是核信号和非核信号，量化之，并观察在每个细胞的胞浆和胞核中的强度差异。

我们使用这种方法生成了大量数据，下面分享了其中一个示例。该图中， LPS 处理的细胞（右）中胞核（白色轮廓）内信号增加确认诱导了炎症反应。

对 NF-κB p65 (D14E12) XP^® Rabbit mAb #8242（绿色）和 CD45 (Intracellular Domain) (D9M8I) XP^® Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #62267（红色）的免疫荧光分析。胞核用 DAPI #4083 染色（未显示），并用白色勾勒出轮廓，以显示与未处理的 iCell 小胶质细胞（左图）相比，LPS 处理（右图）后信号增加。

2. 胞内 CD45

CD45 是一种在免疫细胞表面表达的蛋白酪氨酸磷酸酶，它是用于小胶质细胞的可靠标志物，因为这种蛋白质通过抑制促炎反应，充当小胶质细胞活化的负向调控物。⁴利用标记所有小胶质细胞的膜结合型 CD45 ，我们能够使用 Cell Profiler（一款免费、开源图像分析软件）定义关于小胶质细胞的有趣特征，例如细胞大小和形状。 

我们使用了 CD45 (Intracellular Domain) (D9M8I) XP^® Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #62267 作为每个细胞的复染剂。这项研究最令人着迷且最出乎意料的结果之一是我们观察到的形态变化。我们发现，用 LPS 处理的小胶质细胞比健康细胞略小略圆，而用促炎细胞因子处理的小胶质细胞比健康细胞更大、更扁。对于任何想要使用 iMGL 研究神经炎症以及正在考虑采用不同策略诱导炎症的人，这些出乎意料的发现都值得注意。

相关博客：简化 iPSC 研究：鉴定多能性标志物的抗体

如果您想了解我们如何将兔宿主一抗与兔宿主偶联物一起多重分析，请查看我之前的博客文章，其介绍了一些 IF 多重分析技巧。

3. Phospho-Syk (Tyr525/526)

TREM2 是一种在髓系细胞（尤其小胶质细胞、破骨细胞和巨噬细胞亚群）上表达的细胞表面（触发）受体，其有助于调节炎症和免疫应答。⁵ 被激活时，TREM2 与 DAP12 形成复合物，后者导致引发一系列胞内信号转导事件。

一旦激活，DAP12 就招募蛋白酪氨酸激酶 syk。syk 激活环 (Tyr 525 和 526) 内部的磷酸化可用作 TREM2 信号转导的可靠读出。⁶

对 TREM2 (E4F5G) Mouse mAb #29715（绿色）、DAP12 (E7U7T) Rabbit mAb #97415（红色）和 DAPI #4083（蓝色）的 IF 分析。

一些研究人员发现，磷酰特异性抗体用于免疫荧光充满挑战性，因为可获得的磷酸化蛋白质汇集物有限。然而，在正确的系统中，使用正确的抗体，可获得高质量图像。将炎性小胶质细胞与开来健康的正常 (AHN) 小胶质细胞比较时，我们生成了强有力的数据并随 ​​Phospho-Syk (Tyr525/526) (C87C1) Rabbit mAb #2710 观察到明确的激活作用。 

TREM2 信号转导通路

在 CST 网站上查看完整、交互式通路。

用于小胶质细胞表征的抗体工具

我们将继续开发全面的单克隆抗体产品组合，以进一步表征与疾病相关的细胞过程，旨在了解 AD 和 PD 等神经退行性疾病中小胶质细胞活化的细胞变化。在有许多利用 IF 可以用于表征小胶质细胞的现成单克隆抗体的同时，我们推荐的人反应性抗体列于下表。

除了为这种研究打造抗体工具包外，我们还对有兴趣看看炎症期间 TREM2/DAP12 复合体发生过什么。我们实施过的研究深入揭示了调节 TREM2 依赖性小胶质细胞活化（通过上调或下调该通路）可能怎样有助阐明 AD 病理学。不过，您需要查看我的海报做更多了解！

选择参考文献：

1. Human and mouse microglia look alike, but age differently | ALZFORUM. (2017, July 18).
2. Abud EM, Ramirez RN, Martinez ES, et al. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 2017;94(2):278-293.e9. doi:10.1016/j.neuron.2017.03.042
3. Lively S, Schlichter LC. Microglia Responses to Pro-inflammatory Stimuli (LPS, IFNγ+TNFα) and Reprogramming by Resolving Cytokines (IL-4, IL-10). Front Cell Neurosci. 2018;12:215. Published 2018 Jul 24. doi:10.3389/fncel.2018.00215
4. Tan J, Town T, Mullan M. CD45 inhibits CD40L-induced microglial activation via negative regulation of the Src/p44/42 MAPK pathway. J Biol Chem. 2000;275(47):37224-37231. doi:10.1074/jbc.M002006200
5. Colonna M. The biology of TREM receptors. Nat Rev Immunol. 2023;23(9):580-594. doi:10.1038/s41577-023-00837-1
6. Huang Q, Chan KY, Lou S, et al. An AAV capsid reprogrammed to bind human Transferrin Receptor mediates brain-wide gene delivery. Preprint. bioRxiv. 2023;2023.12.20.572615. Published 2023 Dec 22. doi:10.1101/2023.12.20.572615