对于几代神经科学家而言，使用免疫组织化学方法在解剖学背景下研究大脑通常意味着一次成像一小片。使用传统方法获取微米厚度切片、固定、染色、成像和最后将所有切片拼合在一起，是一项费力的任务，尤其对大块组织更是如此。
但是，如果您可以“观察”完整的小鼠大脑并识别特定细胞并摆脱所有切片和缝合，又会是什么样的情况呢？
完整全脑成像
为了做到这一点，将需要克服数项挑战。您将必须能够充分均匀地固定器官，以在组织和分子水平上维持其结构。固定后，组织必须具有足够的多孔性，因此像抗体这样的分子可以完全穿透器官。完成此操作后，您将需要高效、如实地对整个结构进行成像。如何完成这项任务？
输入整个组织的透明方法。早在 2012 年，我首次接触了这个想法。作为一名分子神经生物学家，我总是利用传统免疫染色技术研究我的目的蛋白质在细胞中或更准确而言在脑组织本身中何时何地表达，神经科学协会的一张海报激起我的兴趣，其标题为《透明化：利用分子分型的快速、完整全脑成像技术》。我想“完整全脑成像”这个标题会激起任何神经科学家的兴趣，为避免您错过海报标题的加粗字体，在此特意强调。
我在这张海报上所见是一种独特的脑成像方法：使大脑完全透明。
实际上，大脑通常是不透明的，这使得在组织深处的成像有问题。为了克服这些困难，作者们使用一种称为透明化的新技术来用物理支撑组织并维持其分子架构的水凝胶固定组织，然后清除膜脂质。结果是一个使用标准共聚焦荧光法可进行染色和成像的彻底透明、完全且完整的脑。2013 年，这张海报的作者们分享了《科学杂志》的年度突破荣誉，同年还认可癌症免疫疗法取得突破。
组织透明化成像方法
快进 5 年且原始技术已经演进，该技术现在更广义地称为“组织透明化”。包括 iDisco、CUBIC、FRUIT 和 SHIELD/SWITCH 在内的新方法试图解决原始透明化方法的一些局限性。最重要的优化包括更均匀和/或更快速的染色方法，这些方法解决了原始方案中较长、复杂的处理时间和苛刻的条件。一些加工条件会改变组织/蛋白质的结构，从而导致基于抗体的染色信号丢失（由于抗体表位的可用性改变）以及遗传编码标签（如 GFP）的荧光减弱（由于荧光团的改变） 。
最近，麻省理工学院的 Kwanghun Chung 实验室描述了使用聚环氧化物优化固定方案的 SHIELD ，这种方案可以更忠实维持组织结构和 GFP 荧光——这是真实进步，因为基因编码的 GFP 广泛用于标记脑细胞和结构。结合均匀分散抗体遍布相关组织并减少标记时间的有效标记处理工作流程，这些方法代表了可能令组织透明化更可靠、更高效和更灵活以允许研究者回答特定生物学问题的进展。
这些组织透明化技术可以解决何种生物学问题？利用这些技术，以下问题皆有可能回答：特定区域背景下细胞命运、定位特定细胞群以揭示解剖回路、检查完整脑中精细突触结构而不引入伪影。这些问题不仅限于发育神经科学或基础神经科学，还适用于理解神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病 (AD)。
人们认为， AD 病理标志（包括 β 淀粉样蛋白 (Aβ) 斑块和神经原纤维缠结 (NFT) ）的动态生成、进展和相互作用促使疾病进展。但是以何种方式呢？Aβ 斑块与什么类型的细胞和/或结构相互作用？这些相互作用在疾病早期和晚期是否不同？疾病是否始于脑的某个区域，也许始于脑的一个子区域中的 NFT，生根，然后一直蔓延遍及脑？哪个在先，是 Aβ 斑块还是 NFT？是否根据疾病的程度或所查看脑区域的不同而有所不同？
组织透明化技术适合回答此类问题。如果您愿意，是否可能在小鼠完整脑中检查 Aβ 图景？答案是肯定的。Kwanghun Chung 联袂 Li Huei Tsai（二位均来自麻省理工学院）生成并提供了此类图景的一个示例，他们检查了使用 β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb #8243 染色的阿尔茨海默病淀粉样蛋白小鼠模型的全脑。
Kwanghun Chung 博士、Li-Huei Tsai 博士及其同事提供的来自阿尔茨海默病小鼠模型的脑的共聚焦重建，该脑经透明化并用 β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb #8243 染色。
研究人员使用 SHIELD 组织透明化技术结合这种抗体来揭示遍布脑的 Aβ 斑块。在可能产生 AD 潜在疗法的激动人心进展中，使用全脑组织透明化术观察小鼠全脑背景下 γ 频率刺激诱导的 β 淀粉样蛋白 (D54D2) 所识别斑块的减少（1，请参阅补充图 S3 和 4）。
这项技术的未来可能是什么？
- 使用扩展显微镜等技术时分辨率超出光衍射极限的超精细细节是否可以成为工作流程的一部分 (2,3 )？
- 如何分析这种数据洪流以生成有意义的生物学洞见？像 LifeCanvas 这样的公司是否可以生成利用自动固定和染色机的工作流程，从而可能使该技术可扩展性更大和更快？
- 最终用户可预期多少抗体优化，或者是否可以将其标准化？可以使用组织透明化技术来研究大脑以外的疾病（例如肿瘤微环境）的标志吗？
这些问题肯定会随着该领域成熟得以解决，NIH BRAIN 倡议每年 4 亿美元投资这种整体型技术，将大大有助于研究者了解我们脑中实际发生什么。
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选择以下参考文献
- Martorell AJ, Paulson AL, Suk HJ 等人Multi-sensory Gamma Stimulation Ameliorates Alzheimer's-Associated Pathology and Improves Cognition. Cell. 2019;177(2):256-271.e22. doi:10.1016/j.cell.2019.02.014
- Ku T, Swaney J, Park JY, et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 2016;34(9):973-981. doi:10.1038/nbt.3641
- Wassie AT, Zhao Y, Boyden ES. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nat Methods. 2019;16(1):33-41. doi:10.1038/s41592-018-0219-4
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