CST 博文: 实验室展望

Cell Signaling Technology® (CST) 的官方博客,我们在此讨论您从工作台上可期望获得什么,分享提示、技巧和信息。

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Antibody Essentials 第 5 部分:抗体选择的重要考虑因素

作为一名研究人员,您知道从根本上讲,您的实验旨在提出新问题和追求新知识,同时建立在现有知识和想法的基础上。当您比较要使用的试剂和抗体时,这种动态如何在实验设计过程中发挥作用?在开始之前收集尽可能多的关于目标分子的已发表信息将有助于确保免疫分析的成功。在最后的 Antibody Essentials 博客中,我们将整合本系列前 4 部分的所有知识,以便您了解在设计实验、选择靶标和选择抗体时应该问哪些问题。目录

了解您的靶标

在有假设驱动的研究中,您将从你的实验模型中的特定生物活动、功能或机制起步。该假设可能来自您的实验室先前实验的结果、阅读文献和/或与合作者的讨论。改进您的假设和实验设计(包括靶标和抗体选择),通常是齐头并进的。然而,在开始抗体搜索之前,您对靶标蛋白的生物学了解得越多,您的抗体选择就越明智。

应考虑的靶标特征包括靶标蛋白的表达水平和亚细胞定位,以及其结构、稳定性和与相关蛋白的同源性。考虑您的蛋白质是否经过任何翻译后修饰或它是否是上游信号事件的目标也很重要,因为这将提供对其整体生物学背景的宝贵见解,并可能为实验设计和抗体选择提供额外的考虑因素。利用 Uniprot 或 Human Protein Atlas 等开放获取资源,并阅读文献以尽可能多地了解靶标蛋白质,是个好主意。有关信号转导的资源,例如 CST Pathway collectionPhosphosite Plus 可以为您的靶标蛋白质的生物学提供重要的背景信息。所有这些信息对于选择对照、设计实验的其他组成部分(例如使用何种激活剂或抑制剂来干扰信号活动)或确定后续实验的下一个目标也很有用。最后,您实验室同事也可以成为信息来源。您还可以查看抗体审查网站,研究人员可以在那里提供有关抗体性能的反馈并分享优化不同免疫测定方案的建议。

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图 1. 实验设计和实验步骤优化选择可能会受到靶标蛋白特性的影响。根据靶标、模型系统、应用程序和实验目的,此处显示的某些靶标特征可能比其他特征更值得考虑。 

 

使用搜索引擎查找抗体

在为您的实验编译目标列表后,您可能会访问 Google 或其他搜索引擎,使用您感兴趣的目标和所需的应用程序(免疫测定类型)作为搜索词。 例如,假设您正在研究激活坏死性凋亡细胞死亡的一种形式)的过程,您的模型系统是培养的小鼠细胞系, 您的首选应用是基于免疫荧光的显微镜检查。 在坏死性凋亡期间,RIP1 和 RIP3 激酶形成复合物并相互磷酸化,从而导致 MLKL 的磷酸化和激活,MLKL 在坏死性凋亡中充当效应物。

那么,您的实验设计可能包括这三种蛋白质的一抗,因此您可以搜索“RIP1 抗体、“RIP3 抗体”或“MLKL 抗体”。您还可以包含一个或多个修饰词,例如“小鼠”、“单克隆”或“磷酸化”。每个抗体搜索的结果将包括来自不同制造商各自网站的产品页面的结果。有时,搜索引擎会返回满足您部分要求但不是全部要求的抗体,因此您需要仔细查看每个产品页面,看看是否有任何包含免疫荧光数据的内容,以及确切的 验证内容是否进行了实验。根据这些信息,您将开始缩小列表的范围。您还可以考虑在 cellsignal.com 上的抗体搜索页面或以试剂为重点的搜索网站(如 Citeab 或 Biocompare)上使用“过滤”功能来缩小搜索范围。但无论哪种方式,您的下一步都是收集更多信息。

物种反应性

检查每个抗体的产品页面,了解支持靶标物种反应性的信息。回想 目标物种反应性和抗体宿主物种之间的区别,输入“RIP3 小鼠抗体”可能会反馈混合的搜索结果,包括不一定与小鼠 RIP3 蛋白靶标发生反应的小鼠宿主抗体 。检查列出的物种反应性,并寻找使用所需物种的细胞或组织进行的验证数据,以支持抗体的物种反应性。

应用

您的初始搜索结果可能包括许多具有所需目标反应性和物种反应性的抗体,其中一些已在您所需的应用中得到验证,但其他尚未得到验证。即使您包含“免疫荧光”或其他应用程序的名称作为搜索修饰符,再次查看每个抗体产品页面上的数据以专门检查在您所需应用程序中执行的验证也是一个好主意。除了检查应用程序是否匹配,还需查找有关用于验证实验的实验设计和协议的详细信息。实验中使用了哪些细胞或组织,它们是否需要用配体刺激和/或用抑制剂处理才能产生所需的结果?实验中是否包括适当的对照?在实验步骤期间如何制备和处理样品?这些问题的答案可以帮助您确定抗体是否可能适用于您的样品和实验步骤,或者您是否需要在扩大实验规模之前考虑添加自己的验证测试。

无论使用何种应用,没有单一的测定足以确定抗体的有效性。确认抗体具有特异性和敏感性取决于所使用的应用和实验步骤、所分析样品的类型和质量以及抗体本身的固有生物物理特性。您手中的抗体在一项应用中的性能,例如使用细胞培养模型进行免疫荧光 - 即使包括目标分子的敲除 - 不一定与其他应用和其他实验步骤的特异性或性能有关,例如石蜡包埋组织样本的免疫组织化学分析。这是由于样品制备的差异会影响表位结构或可用性,或者由于抗体结合条件的差异会影响抗体-抗原相互作用的强度。您可以在下面的验证标志视频中了解有关 CST 如何验证抗体的更多信息。它概述了我们使用的不同策略,您可以根据自己的验证实验进行调整。

 

 

 

 

抗体宿主物种、同种型和子类注意事项

为什么要注意靶标抗体的宿主物种和同种型?许多免疫测定的方案包括一抗的孵育步骤,该抗体与您的靶标结合,然后是与偶联的二抗的孵育步骤,以便在免疫测定结束时产生信号。这种方法用于蛋白质印迹法中的化学发光检测,或用于免疫细胞化学、流式细胞术和其他测定中的基于荧光的扩增和检测。这需要识别一抗的二抗,这是一抗的宿主物种和同种型 变得重要的原因。一些二抗将识别一个物种(如小鼠)的多个同种型,其他的将更窄,仅识别一种同种型(如小鼠 IgG),甚至更窄地仅识别一个亚类(如小鼠 IgG2a)。匹配一抗和二抗还可以设计多重实验,这些实验使用具有不同同种型和荧光团组合的一抗和二抗对。或者,可以考虑直接偶联一抗;如果您采用这种方法,您最好会希望看到使用您将使用的特定抗体偶联物生成的验证数据。

U5-F2图 2. 二抗与酶(如 HRP)偶联,用于蛋白质印迹的化学发光检测(左图),或与具有不同发射波长的荧光团偶联,用于间接免疫荧光(右下图)。 

 

与样品材料来自的物种相关,抗体宿主物种也是一个重要的考虑因素。在免疫组织化学中,当抗小鼠二抗与组织样本中的内源性小鼠免疫球蛋白结合时,可能会出现小鼠对小鼠交叉反应 ,从而导致不需要的背景信号。在处理某些小鼠组织样本时,这可能会限制小鼠衍生抗体的效用。如果二抗在样品中非特异性结合,也可能发生类似的背景染色,因此您必须选择经过充分验证的二抗并包括相关对照以避免产生误导性结果。

U5-F3图 3. 使用针对α-平滑肌肌动蛋白小鼠宿主抗体和抗小鼠二级检测试剂(左上图)或用单独的抗小鼠二级检测试剂(右上图)进行小鼠肺组织的免疫组织化学分析后者表明存在小鼠对小鼠背景染色。通过切换到针对相同靶标的兔宿主抗体和抗兔二级检测试剂(左下图),消除了小鼠对小鼠背景。 

 

抗体克隆注意事项

我们在之前的 Antibody Essentials 博客中讨论了单克隆抗体与多克隆抗体相比的优缺点。现在,我们只是重申,如果可用,建议您为研究选择重组单克隆抗体,以从一致的性能中受益。但是,如果您正在检测新目标,那么在开发单克隆抗体之前,多克隆抗体可能是您唯一的选择。如果情况确实如此,您可以决定使用多克隆抗体进行初步研究,然后在可用时再决定是使用小鼠单克隆抗体还是兔单克隆抗体。与多克隆抗体相比,小鼠和兔单克隆抗体具有许多优势,这意味着在它们之间进行选择将在很大程度上取决于免疫分析的独特要求。

抗体生产注意事项

虽然大多数市售抗体均以含水缓冲液中的纯化制剂形式提供,但您可能会遇到纯化程度较低的制剂,例如从血液中分离的粗血清。或者,如果杂交瘤用于单克隆生产,则可以从细胞培养基或从注射了杂交瘤的小鼠收集的腹水中收集抗体。如果您计划将抗体与酶或荧光染料偶联,或者如果您希望进行免疫沉淀等实验,这些可能会出现问题,因为抗体浓度通常较低。这些粗制备物还可能包含其他蛋白质或成分,这些蛋白质或成分可能会干扰抗体偶联或对您的检测产生其他意想不到的后果,这意味着您需要考虑是否需要进行额外的纯化。虽然可以在您自己的实验室中进行缓冲液交换并浓缩抗体,但这通常很耗时,并且极易发生变异。如果您在使用专业或高通量免疫分析形式的实验室或核心机构工作,您可以考虑无载体或定制配方批量购买以满足您的需求。对于大多数实验室科学家来说,购买标准配方的纯化抗体提供了足够的选择,可以使用常见应用和相当标准的实验步骤来探测他们感兴趣的目标。

抗体的特异性和敏感性

在第一个 Antibody Essentials 博客中,我们定义了抗体特异性和灵敏度 当您选择抗体来支持您的研究时,这两种因素都至关重要。首先,我们考虑一下特异性;如果您计划检测一个密切相关的蛋白家族的单个成员,您需要确保所选的抗体只识别您感兴趣的蛋白,而不与其他家庭成员产生交叉反应。虽然序列比对可以给出同源性的指示,但确定抗体特异性的唯一方法是查看证明是这样情况的测试数据。一家值得信赖的抗体制造商将在抗体验证过程中生成这些数据,让您不再需要自己进行交叉反应性测试。它们可能已经确定了抗体是否可以识别其他物种中的等效蛋白质靶标。 抗体具有跨物种反应性,在某些情况下可能很有用,例如,如果您在人和小鼠细胞系中比较药物的反应。但在许多其他情况下还是应该避免,例如,如果您计划使用抗体只监测细胞系中经改造的蛋白质的表达水平,但如果抗体也检测到宿主细胞表达的内源性蛋白质,那您可能就显著高估了改造的蛋白质的表达。

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最后,您将要考虑抗体敏感性,这让我们又回到了解您的抗原靶标。如果您的蛋白质丰度低,您可能需要比较几种不同的抗体,看看哪种抗体在您的免疫测定中产生最强的信号,同时保持特异性。如果使用磷酸化特异性抗体,您需要确认该抗体在特定残基磷酸化时实际上对您的靶标具有特异性,并且它对您的应用足够敏感。然后,考虑已知表达磷酸化蛋白的细胞类型,以及是否需要刺激来检测它。如果您计划在具有荧光读数的免疫测定中使用直接偶联的一抗,您需要了解您选择的抗体是否可偶联至您的仪器可以检测的明亮荧光团,并考虑您的靶标的丰度。

与同行协商并得出结论

搜索已发表的文献并深入研究论文中的材料和方法以及补充图,可能会获得有关您正在考虑的抗体的更多信息。看到特定抗体在您所需的应用中使用类似的样品材料(如细胞系或组织),可以帮助您树立信心,让您确信您的选择是正确的。然而,重要的是要记住,文献中的不准确或不完整的信息是造成可重复性危机的一个因素,因此请始终保持批判性的眼光。当然,您的同事也可以成为信息来源。他们可能已经对不同的抗体进行了自己的动手比较,或者可能已经针对您计划使用的相同实验模型优化了抗体。您还可以查看抗体评论网站甚至社交网络,研究人员有时会在这些网站上提供有关抗体性能的反馈。同样,细节很重要,在您确信抗体已经过验证并在您手中工作之前,一定要保持适度的怀疑态度。 

我们希望我们为您提供了一些有用的信息,以帮助您选择抗体来支持您的研究,但如果您只从 Antibody Essentials 中获取了两条信息,那就是:

  1. 没有单一的测定足以确定抗体的有效性。

  2. 批判性地思考您计划使用的抗体,就像您自己生产和验证它们一样。

牢记这些原则将大大有助于避免研究中的挫折,并确保您可以充分利用这些重要且有价值的研究试剂。

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