抗体选择的重要考虑因素

作为研究人员，您的实验旨在提出新问题，并基于当前研究来追求科学知识。当您在比较选择何种抗体与试剂时，这一动态因素会如何影响实验设计？在开始之前收集尽可能多的有关靶标分子的信息将有助于确保免疫测定的成功。

在最后一篇《抗体要点》博客中，我们将基于本系列前四篇文章的所学知识，帮助您在设计实验、选择靶标以及选择正确的抗体试剂时，确定需要提出哪些问题。

了解您的靶标蛋白

在假设驱动的研究中，您将从关于实验模型中特定生物功能、活性或机制的想法开始。该假设可能来自先前实验的结果、文献综述，或与合作者的讨论。完善您的假设和实验设计（包括靶标和抗体选择）通常是同步进行的。您对靶标蛋白生物学的理解越深入，您的抗体选择就会越明智。

您应考虑的靶标蛋白特征包括其表达水平和亚细胞定位，以及其结构、稳定性和与相关蛋白的同源性。考虑您的蛋白质是否会经历任何翻译后修饰 (PTM)，或是否为上游信号转导事件的靶标，这一点也很重要。这些因素将为了解其整体生物学背景提供宝贵见解，并能指导您的实验设计和抗体选择。

图 1. 靶标蛋白的特征可能会影响实验设计和实验步骤优化的决策。根据靶标、模型系统、应用程序和实验目的，此处显示的某些靶标特征可能比其他特征更值得考虑。

查阅开放获取资源（如 Uniprot 或人类蛋白质图谱）以及阅读现有文献，也是了解靶标蛋白的重要途径。信号转导方面的资源，例如 CST 细胞信号转导通路图和 PhosphoSitePlus（一个经过整理的蛋白质修饰和系统生物学数据库），可以提供关于靶标蛋白生物学的重要背景信息。这些信息还可帮助选择实验对照、设计实验的其他组成部分（例如使用何种激活剂或抑制剂来干扰信号转导活动），或确定后续实验的下一个靶标。

最后，您人际网络中的同事和同行也可以成为信息来源。查看抗体评论网站，了解研究人员关于抗体性能的反馈，并寻找优化不同免疫测定实验步骤的建议。

Santa Cruz (B-9) sc-7480 对比 CST Bax Antibody

博客：警惕 Bax 抗体陷阱：问题抗体或致数百万研究经费付诸东流

使用搜索引擎查找抗体

在编制好实验靶标列表后，您很可能会使用您感兴趣的靶标和所需应用作为搜索词，去访问谷歌或其他搜索引擎。

例如，如果您正在研究使用免疫荧光显微镜技术激活培养的小鼠细胞系中坏死性凋亡（一种受调控的细胞死亡形式）的过程，您的实验设计很可能会包括针对所涉及关键蛋白的一抗。在坏死性凋亡期间，RIP1 激酶和 RIP3 激酶形成复合体并相互磷酸化，从而导致 MLKL 磷酸化和激活，MLKL 在坏死性凋亡中充当效应子。因此，您可能会搜索“RIP1 抗体”、“RIP3 抗体”或“MLKL 抗体”，并在查询中包含诸如“小鼠”、“单克隆”或“磷酸化”等术语。

每次抗体搜索的结果将包括来自不同抗体制造商的产品页面。有时，搜索引擎会返回符合您部分（但非全部）要求的抗体，因此您需要检查每个产品页面的具体细节。您需要查看执行了哪些验证实验，并寻找免疫荧光数据以确保该抗体已在您预期的应用中进行过测试。

根据这些信息，您将开始缩小列表范围。您还可以考虑使用在 cellsignal.com 上抗体搜索页面中或聚焦于试剂的搜索网站（例如 CiteAb 或 Biocompare）上的“过滤”功能缩小搜索范围。但无论哪种方式，下一步应收集更多信息。

靶标物种反应性

检查每个抗体的产品页面，了解支持靶标物种反应性的信息。回忆靶标物种反应性和抗体宿主物种之间的区别，记住短语“RIP3 小鼠抗体”可能返回混合型搜索结果，包括实际不与小鼠 RIP3 蛋白靶标反应的小鼠宿主抗体。

查看列出的物种反应性，并寻找用来自所需物种的细胞或组织进行的验证数据，以支持抗体的物种反应性。

应用

您的初始搜索结果可能包括许多具有所需目标反应性和物种反应性的抗体，其中一些已在您所需的应用中得到验证，但其他尚未得到验证。即使您在搜索条件中包含“免疫荧光”或其他应用名称，也最好查看产品页面上的数据，以确保在您预期的应用中进行了该验证测试。请记住，在一个应用中的验证并不一定意味着抗体会在另一个应用中有效，必须在每个应用中独立进行验证测试，以确保抗体的特异性、灵敏度和可重复性。

当您检查抗体的预期应用时，请关注验证测试中使用的实验设计和实验步骤的细节。使用了哪些细胞或组织？它们是否受到配体的刺激或经过抑制剂的处理？是否包含了适当的对照？样品是如何制备和处理的？这些问题的答案可以帮助您确定抗体是否可能适用于您的样品和实验步骤，或者您是否需要在扩大实验规模之前考虑添加自己的验证测试。

请记住，即使使用靶标分子敲除方法，单一的检测也不足以确定抗体的有效性。确认抗体具有特异性和敏感性取决于所使用的应用和实验步骤、所分析样品的类型和质量以及抗体本身的固有生物物理特性。抗体在一种应用（例如使用细胞培养模型的免疫荧光）中的表现，并不一定能预测其在另一种应用和另一种实验步骤（例如石蜡包埋组织样品的免疫组织化学）中的特异性或表现。这是因为样品制备会影响表位的结构和可用性，而不同的结合条件会改变抗体-抗原相互作用的强度。

在下面的验证标志视频中，您可以了解有关抗体性能以及 CST 如何验证抗体的更多信息。它概述了我们使用的不同策略，您可以根据自己的验证实验进行调整。

抗体宿主物种、同种型和亚类的考量

为什么您应注意靶标抗体的宿主物种和同种型？许多免疫分析使用偶联的二抗，在一抗与其靶标结合后产生信号。这种方法用于蛋白质印迹法中化学发光检测以及用于免疫细胞化学、流式细胞术和其他测定法中基于荧光的扩增和检测。该过程需要一种识别一抗的二抗，这就是一抗的宿主物种和同种型变得至关重要之处。

一些二抗能识别来自一个物种（例如小鼠）的多种同种型，而其他二抗只识别一种同种型（例如小鼠 IgG）或亚类（例如小鼠 IgG2a）。匹配的一抗和二抗还可能实现设计多重实验，这些实验使用具有不同同种型和荧光团组合的一抗和二抗对。或者，可以考虑直接偶联的一抗；如果您走这个路线，您会理想地希望看到使用您将要使用的特定抗体偶联物生成的验证数据。

蛋白质印迹法和直接与间接免疫荧光法中的二抗 图 2. 二抗与酶（如 HRP）偶联，用于蛋白质印迹的化学发光检测（左图），或与具有不同发射波长的荧光团偶联，用于间接免疫荧光（右下图）。

避免交叉反应性

抗体的宿主物种与您样品材料的来源物种之间的关系也很重要。在免疫组织化学中，当抗小鼠二抗与样品中小鼠内源性免疫球蛋白结合时，可能出现小鼠对小鼠交叉反应，从而导致不必要的背景信号。在处理某些小鼠组织样品时，这可能限制小鼠衍生抗体的效用。如果二抗在样品中非特异性结合，也可能会发生类似的背景染色，因此至关重要的是，选择经充分验证的二抗并纳入相关对照以避免产生误导性结果。

避免在使用不同宿主物种的二抗的免疫组织化学检测中出现交叉反应图 3. 使用针对 α-平滑肌肌动蛋白的小鼠宿主抗体和抗小鼠二级检测试剂（左上图）或使用单独的抗小鼠二级检测试剂模拟染色（右上图）进行的小鼠肺组织免疫组织化学分析。后者表明存在小鼠对小鼠背景染色。通过切换到针对相同靶标的兔宿主抗体和抗兔二级检测试剂（左下图），消除了小鼠对小鼠背景。

抗体克性隆：单克隆、多克隆和重组

我们在先前的《抗体要点》博客中讨论过单克隆抗体对比多克隆抗体的优缺点。现在，我们只想重申，当可获得时，建议您选择重组单克隆抗体，以便您的研究得益于性能一致。

多克隆抗体：一种与多个表位结合的抗体混合物，可提供强信号，但具有较高的批间差异以及可能存在交叉反应。

单克隆抗体：单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆，具有高度特异性，仅与单个表位结合，因此交叉反应性极小，批间差异较小。

重组抗体：利用体外基因工程生产的单克隆抗体。其优点包括无动物生产、卓越的批间一致性以及可扩展的供应能力。

然而，如果您正在检测一个新靶标，那么在开发出单克隆抗体之前，多克隆抗体可能是您的唯一选项。如果情况确实如此，您可以决定用多克隆抗体进行初步研究，随后在小鼠单克隆抗体和兔单克隆抗体可获得时，在二者间做出决定。与多克隆抗体相比，小鼠单克隆抗体和兔单克隆抗体二者具有许多优势，这意味着在二者间选择将很大程度上取决于您免疫测定法的独特要求。

抗体生产注意事项

虽然大多数市售抗体均以含水缓冲液中的纯化制剂形式提供，但您可能会遇到纯化程度较低的制剂，例如从血液中分离的粗血清。或者，如果杂交瘤用于单克隆生产，则可以从细胞培养基或从注射了杂交瘤的小鼠收集的腹水中收集抗体。如果您计划将抗体与酶或荧光染料偶联，或者如果您希望进行免疫沉淀等实验，这些可能会出现问题，因为抗体浓度通常较低。这些粗制备物还可能包含其他蛋白质或成分，这些蛋白质或成分可能会干扰抗体偶联或对您的检测产生其他意想不到的后果，这意味着您需要考虑是否需要进行额外的纯化。

虽然可以在您自己的实验室中进行缓冲液交换并浓缩抗体，但这通常很耗时，并且极易发生变异。如果您在使用专业或高通量免疫分析形式的实验室或核心机构工作，您可以考虑无载体或定制配方或批量购买以满足您的需求。对于大多数实验室科学家来说，购买标准配方的纯化抗体提供了足够的选择，可以使用常见应用和相当标准的实验步骤来探测他们感兴趣的目标。

抗体的特异性和敏感性

在第一篇 Antibody Essentials 博客中，我们定义了抗体特异性和敏感性。当您选择用于支持研究的抗体时，两者都至关重要。

博客：您是否信任您的研究抗体？

针对靶标蛋白的抗体特异性

特异性确保您的抗体仅识别靶标蛋白，而不会与其他相似蛋白发生交叉反应。当您需要检测紧密相关蛋白家族中的单个蛋白时，这一点尤为重要——您需要确保所选抗体仅识别目标蛋白，而不会与其他家族成员发生交叉反应。虽然序列比对能够提示同源性，但确保抗体特异性的唯一方法是审阅测试数据。值得信赖的抗体制造商将在抗体验证期间生成这些数据，从而不需要您亲自进行交叉反应性测试。他们可能已经确定了抗体是否可以识别其他物种中的等同效蛋白质靶标。虽然跨物种反应性可能在某些情况下有用，例如，如果您正在人细胞系和小鼠细胞系中比较对药物的反应，但在许多其他情况下应该避免跨物种反应。

例如，如果您打算使用该抗体监测细胞系中已工程化蛋白质的表达水平并且如果该抗体还检出宿主细胞表达的内源性蛋白质，则您可能显著高估蛋白质表达。

图 4. PKCδ 的同工型特异性检测。将细菌表达的、GST 标记的、纯化 PKC 同工型上样到用于 SDS-PAGE 的泳道中并使用 PKCδ 抗体（上图）或 GST 抗体（下图）进行蛋白质印迹分析。

针对靶标蛋白的抗体灵敏度

最后，您将要考虑抗体敏感性，这让我们又回到了解您的抗原靶标。如果您的蛋白质丰度低，您将需要比较几种不同的抗体，看看哪种抗体在您的免疫测定中产生最强的信号，同时保持特异性。

对于磷酸化特异性抗体，您需要确认该抗体在特定残基磷酸化时对您的靶标具有特异性，并且它对您的应用足够敏感。考虑已知表达磷酸化蛋白的细胞类型，以及是否需要刺激来检测它。

如果您计划在具有荧光读数的免疫测定中使用直接偶联的一抗，您需要确定您选择的抗体是否可偶联至您的仪器可以检测的明亮荧光团，并考虑您靶标的丰度。

与同行协商

搜索已发表的文献并深入研究论文中的材料和方法以及补充图，可能会获得有关您正在考虑的抗体的更多信息。看到特定抗体在您所需的应用中使用类似的样品材料（如细胞系或组织），可以帮助您树立信心，让您确信您的选择是正确的。然而，重要的是要记住，文献中的不准确或不完整的信息是造成可重复性危机的一个因素，因此请始终保持批判性的眼光。当然，您的同事也可以成为信息来源。他们可能已经对不同的抗体进行了自己的动手比较，或者可能已经针对您计划使用的相同实验模型优化了抗体。您还可以查看抗体评论网站甚至社交网络，研究人员有时会在这些网站上提供有关抗体性能的反馈。同样，细节很重要，在您确信抗体已经过验证并在您手中工作之前，一定要保持适度的怀疑态度。

我们希望我们为您提供了一些有用的信息，以帮助您选择抗体来支持您的研究，但如果您只从 Antibody Essentials 中获取了两条信息，那就是：

没有单一的测定足以确定抗体的有效性。
批判性地思考您计划使用的抗体，就像您自己生产和验证它们一样。

牢记这些原则将大大有助于避免研究中的挫折，并确保您可以充分利用这些重要且有价值的研究试剂。

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