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Antibody Essentials 第 4 部分:多克隆与单克隆抗体

在本博客中,我们将深入探讨多克隆抗体和单克隆抗体的一些优缺点,并解释用于研究的小鼠抗体和兔源抗体之间的主要区别。正如在 Antibody Essentials 第 3 部分中一样,我们希望您继续思考抗体,就像您自己生产它们一样,因为拥有正确的心态是产生您可以信赖的免疫测定结果的关键。

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抗体克性隆:词语中的内容是什么?

之前我们讨论了抗体的分类,其中一种方法是将它们分类为多克隆或单克隆。但正如您注意到,“克隆”一词非常灵活——它可以用来指复制和编辑基因序列、操纵和扩增携带这些基因的细胞,甚至克隆整个机体——那么它在这里是什么意思?为了将克隆置于抗体环境中,让我们回忆一下我们之前对抗体多样性的讨论,激活的 B 细胞的增殖以放大免疫反应并增加抗体产生。如果想象一个场景,即用具有 10 个表位的病毒蛋白对动物进行免疫接种,该蛋白激活 10 个不同的 B 细胞,我们就会知道,作为 VDJ 重组的结果,这些 B 细胞中的每一个都在其表面表达了一种独特的抗体。因此,响应外源蛋白的 B 细胞增殖将导致十个不同的 B 细胞群,其中每个群中的所有 B 细胞都是无性系相关的。一个克隆群体中的所有细胞都来自同一个祖先 B 细胞,并且在表达相同抗体方面在功能上是相同的。现在考虑一下,在宿主中,所有十个 B 细胞群或克隆共同存在,在血浆中增殖并产生抗体。如果我们收集血液并从血清中纯化抗体,我们将得到由 10 个不同 B 细胞克隆产生的 10 种不同抗体的混合物,因此称为多克隆抗体。

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图 1. 多克隆抗体制剂实际上包含来自不同 B 细胞克隆的不同抗体的混合物。

 

现在再想象一下,我们不是收集混合血清,而是从动物身上分离出所有免疫细胞,并准备在多孔板中进行细胞培养。通过稀释细胞混合物,使每个孔不接收细胞或接收一个细胞,我们可以在每个孔中产生相同增殖细胞的单个克隆(当然,这应该通过后续测试来验证)。因此,接种了十个 B 细胞之一的孔现在将拥有纯克隆相关 B 细胞群,表达相同的抗体。然而,由于 B 细胞不会无限期地继续分裂,因此只能产生有限数量的抗体。

为了克服这个缺点,Kohler 和 Milstein 在 1975 年开发了杂交瘤技术,正如我们在之前的关于抗体历史的博客中所述。脾细胞(包括 B 细胞的脾细胞群)与永生化的骨髓瘤肿瘤细胞融合,形成永生化的杂交瘤细胞。每个杂交瘤细胞表达与其 B 细胞祖先相同的抗体。使用专门的培养基进行选择步骤,其中仅融合细胞会生长,然后通过有限稀释进行克隆以建立单克隆系。杂交瘤细胞系的后续扩增、测试/表征和长期储存确保了单克隆抗体的长期来源。1970 年代之后,已经开发出替代重组方法来产生不依赖于永生化的单克隆抗体。

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图 2. 单克隆抗体的产生包括单个杂交瘤克隆的分离、选择和扩增步骤,产生仅由一种抗体组成的制剂。 

 

近年来,多克隆和单克隆抗体的使用显著增加。每种类型的抗体都有其自身的优点和缺点,其中许多抗体开发商和最终用户的权重可能不同。您会记得,在过去的几十年中,学术研究人员通常会在将抗体用于研究之前自行开发和验证抗体,但今天,开发人员和用户的角色通常是分开的。我们将从两个角色的角度探讨多克隆和单克隆抗体在研究中的优缺点。

 

多克隆抗体的优缺点

首先让我们探索多克隆的优势。开发人员和用户之间所认为的好处存在明显的重叠。多克隆抗体的生产速度快且成本低,可以更快地被推向市场,这样科学家们可以更快地在实验中使用它们。当人们对“热门”靶标越来越感兴趣时,这可能就尤其重要了,该靶标可能是一种新的或以前未充分研究的蛋白质,被认为具有重要的生物学作用;通常,针对热门靶标的多克隆抗体在单克隆抗体之前可用。虽然多克隆通常在兔子中产生,但它们也可以从山羊、绵羊和大门等物种中以较大的体积产生,为制造商提供更多适合支持大规模筛选的材料和为研究人员提供适合的抗体量。

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图 3. 多克隆抗体的优缺点。

 

多克隆抗体的一个主要缺点是它们的供应受到动物宿主寿命的限制。多克隆还表现出相当大的批次间差异,因为随着时间的推移,不同批次可能从同一动物收集,或从不同动物收集,这两种情况都可能导致多克隆批次间存在差异。这意味着抗体制造商需要不断生产和验证新的抗体批次,以及开发合适的替代产品。因此,研究人员可能需要重新优化从一个抗体批次到下一个批次的实验条件,或者甚至在产品过时时重新配置分析级联。多克隆制剂的另一个缺点是与单克隆制剂相比,它们可能降低特异性。多克隆制剂由多个抗体组成,每个抗体识别不同的表位,并且表现出非特异性反应性的风险更大。

单克隆抗体的优缺点

现在让我们将注意力转向单克隆抗体。单克隆抗体的一个主要优点是它们的特异性,这是由于它们天生就只识别一个表位。单克隆抗体优化是通过在抗体开发过程中筛选和选择最佳克隆来实现的。与多克隆抗体相比,生产高度特异性的单克隆抗体可为抗体开发人员提供优于市场上其他产品的竞争优势,同时为研究人员提供比多克隆抗体更好的目标识别和更少背景信号的优势。一些实验室的实验或对照可能会在发表一篇或一系列论文的过程中运行数月、一年甚至多年。由于研究人员希望比较不同实验和不同研究的数据,并且还希望其他实验室复制和加强他们自己的发现,因此了解试剂的特异性和性能不会发生显著变化非常重要。总体而言,单克隆抗体以其一致的性能、有保证的长期生产和相对简单的放大而闻名,无论项目的时间进度如何,都能为制造商和研究人员提供稳定的供应和实验可靠性。尽管有许多优点,但单克隆抗体的一个缺点是它们比多克隆抗体的生产更耗时且更昂贵。如果尚未开发出单克隆抗体,研究人员可能会考虑使用现有的多克隆抗体,然后在可用时切换到单克隆抗体。

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图 4. 单克隆抗体的优缺点。

 

最终,在决定使用多克隆抗体还是单克隆抗体之前,您需要对您的研究目标进行评估,同时考虑您特定检测的需求,以及能够满足您的实验目标的抗体的成本和可用性。

优点和缺点:兔子和小鼠作为宿主物种

兔源和小鼠源抗体是研究中使用最广泛的一抗试剂。过去,更常见的是将小鼠宿主用于单克隆抗体。这是由于缺乏适合兔子 B 细胞的杂交瘤融合细胞,直到 1995 年,Katherine Knight 及其同事开发了转基因兔子来创建浆细胞瘤细胞系。因此,兔单克隆制剂在今天得到更广泛的应用。使用兔子生产抗体的一个优势是它们比小鼠具有更多样化的免疫组库,这意味着它们能够产生针对更广泛抗原的免疫反应,包括小肽和生物分子。兔子抗体通常还对其靶标具有更高的亲和力。从抗体开发人员的角度来看,更大的多样性和亲和力意味着生产范围更广的高选择性抗体,而从研究人员的角度来看,这意味着有更多的抗体试剂可供选择。

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图 5. 兔子作为宿主物种的优缺点。

 

尽管具有更大的多样性和亲和力,但兔单克隆抗体生产的一个特定缺点是该技术对于生产商来说再次非常耗时且成本高昂,这意味着兔单克隆抗体对消费者而言通常比在小鼠宿主中产生的替代品更昂贵。计划在同一检测中组合多种兔 IgG 的研究人员将需要考虑更复杂且可能困难的多重实验方案,例如多重 IHC 的连续抗体标记和剥离策略。或者,可以使用具有不同荧光团标记的多种兔抗体偶联物进行直接检测,而无需在多重检测中使用二抗,但直接偶联抗体-荧光团组合的可用性可能是一个限制因素。

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图 6. 小鼠作为宿主物种的优缺点。

 

由于小鼠单克隆抗体技术的存在时间比兔单克隆抗体技术要长得多,因此您可能会经常从小鼠宿主中找到比兔子宿主更多的可用于靶标的克隆。对开发人员的另一个优势是,能够使用小鼠抗体(例如 IgG1、IgG2a)设计子类转换,而兔子只有一个类。对于抗体用户而言,与来自不同类别或亚类的小鼠抗体进行多重检测相对简单。从抗体开发者的角度来看,小鼠饲养比兔子饲养容易;此外,通过重组技术改造抗体的遗传方法更适合小鼠而不是兔子,这意味着小鼠通常是抗体生产的首选。

对于抗体生产商而言,使用小鼠生产抗体的局限性在于,与兔子相比,它们提供的抗体多样性较低,并且可能并不总是对小肽抗原和分子产生足够的免疫反应。对于研究人员来说,一个潜在的问题是小鼠对小鼠的交叉反应性,即抗小鼠二抗与小鼠样本材料中的内源性免疫球蛋白结合,产生不需要的背景信号。这个问题在 IHC 实验中很常见,其中小鼠品系通常用于疾病模型;虽然可以通过包括mouse-on-mouse 阻断步骤来消除它,但这样做增加了免疫染色步骤。

 

既然我们已经讨论了多克隆抗体和单克隆抗体以及兔子和小鼠宿主抗体的优缺点,我们希望您对这些基本试剂如何适合您的研究计划有更清晰的了解,以及为什么您可能并不总是能够为您的靶标采购首选抗体。无论您的抗体是在小鼠、兔子还是其他物种中产生的,仍然需要针对您实验中的应用和输入样本类型进行验证,以便您对数据充满信心。我们将在此基础上进一步考虑您在为研究选择抗体时应该询问哪些类型的问题。

 

接下来,抗体选择的重要注意事项

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