CST 博文: 实验室展望

Cell Signaling Technology® (CST) 的官方博客,我们在此讨论您从工作台上可期望获得什么,分享提示、技巧和信息。

所有帖子

Antibody Essentials 第 1 部分:抗体基础知识

作为科学家,您可能已经认识到抗体在研究中的重要作用。研究界在过去几年中一直在谈论抗体验证。Antibody Essentials 系列的目的是消除一些关于什么是好抗体的困惑,并就您在选择抗体提出的多种问题提供指导,让你了解不同抗体的特性和局限性,有助您获得可靠的免疫测定数据,让您更有信心地发表您的研究结果。

目录

在这一系列第 1 部分,我们将讨论研究可重复性危机和抗体验证的重要性,然后讲解一些抗体基础知识,包括结构和功能、结合特性以及可能使用抗体的检测类型。稍后,我们将介绍抗体验证的概念,以及为什么不同的抗体特性如此重要。

 

抗体可重复性危机

人们在谈论研究可重复性危机时是什么意思?近年来,越来越明显的是,文献中的许多实验结果根本无法复制(1-4)。您甚至可能亲历过——试图重复另一个实验室发表但没有成功的实验。或者,有一天您的实验效果很好,第二天就不顺利了,您必须弄清楚原因。有许多潜在的可重复性危机来源:

  • 实验设计
  • 数据的错误分析或解读
  • 细胞系污染
  • 模型生物体的复杂性
  • 表征不佳或误用的试剂

抗体属于以上第 5 个来源,虽然可重复性问题不能完全归咎于抗体,但的确有些是来自抗体问题。

U1-F1-nolabel

图 1. 2010年后,研究界开始质疑为什么许多研究无法复制,这种现象称为可重复性危机。
 

从广义上讲,哪些因素可能导致抗体缺乏实验可重复性?首先,提供抗体的公司可能很少(如果有的话)以抗体验证的形式进行质量控制。其次,购买抗体的研究人员可能没有考虑到他们的实验模型与供应商用于验证抗体的模型之间的差异,就轻易相信抗体在没有优化的情况下就发挥如广告所言的作用。此外,与之前发布的内容相比,最终用户的实验中的实验步骤或条件可能存在差异。还有,已发表研究论文的材料和方法细节不足是造成可重复性问题的一个原因,尽管科学和出版界已经通过同行和编辑审查来解决这个问题。最后,缺乏全面的培训加上论文发表的压力肯定会加剧上述问题。提高抗体实验可重复性是供应商、抗体购买者、教育者和导师以及期刊的共同责任。对于研究者,除了了解抗体危机来源因素,其实,了解抗体的制造方式及其工作原理将大大增加您生成可靠、可重复性数据的机会。

U1-F2-nolabel

图 2. 可重复性是共同的责任。抗体供应商、最终用户/研究人员、导师和期刊都可以在提高研究的可重复性方面发挥作用。
 

什么是抗体,我们如何使用它们?

让我们从头开始:从生物学上讲,什么是抗体,什么使抗体可用作实验室工具?抗体是一种复杂的蛋白质,由一类特定的免疫细胞(称为 B 细胞)在适应性免疫反应过程中产生。适应性免疫系统起源于有颌鱼类并存在于所有高等脊椎动物中,它赋予了一种分子记忆形式,这种记忆具有高度特异性,并且能够识别来自包括病原体在内的外来来源的分子。由于 B 细胞发育过程中发生的 DNA 重排,人类适应性免疫系统具有产生数十亿独特抗体的理论库,我们将在之后本系列博客中介绍。由于不同的抗体应特异性识别不同的表位和抗原,因此科学家可以利用抗体特异性来检测研究实验中的生物分子,或在疾病生物标志物或妊娠检测等诊断应用中,或在癌症治疗等治疗干预中。

U1-F3

图 3. 抗体可用于多种不同类型的应用形式或免疫测定。
 

当科学家谈到使用抗体进行研究时,他们最有可能进行某种形式的免疫测定,涵盖使用抗体检测、捕获或中和目标的广泛技术。常见类型的免疫测定或“实验应用”如上图 3 所示。根据选择的免疫测定,可以使用单个抗体、抗体对或一组复杂的抗体。小鼠和兔源抗体最常用于科学研究,其次来自大鼠和豚鼠等啮齿动物以及山羊、绵羊和驴等有蹄哺乳动物的抗体也很受欢迎。近年来,鸡抗体和单链骆驼抗体同样成为主流。无论免疫测定或抗体宿主种类如何,任何免疫测定实验的成功都取决于抗体是否经过验证以及针对预期应用和实验模型优化的方案。否则,产生的数据可能会导致错误的结论。

U1-F4-nolabel

图 4. 许多脊椎动物物种都有抗体,但大多数用于研究的抗体是在哺乳动物物种中产生的。

 

应该注意的是,“验证”一词本身对于不同的科学家来说可能意味着略有不同的含义。如果您在学术实验室,您可能会想到 Validation,因为它适用于实验中使用的单个抗体或试剂。如果您在一家对患者样本进行临床前、转化或临床诊断工作的制药或生物技术公司工作,在评估单个试剂的性能时,您可能会看到术语“Verification”而不是“Validation”。在临床环境中,“Validation”往往应用于整个工作流程(例如用于诊断目的的患者活检材料的免疫组织化学),其中包括实验步骤和分析以及试剂。未来,我们将在更学术的定义中使用“Validation(验证)”,但是,在这里我们谈论的是验证抗体的性能,不是整个实验或工作流程。

 

抗体结构和功能

通常,一个抗体单元由四种多肽组成:两条相同的重链和两条相同的轻链。每条重链包含三个恒定域和一个可变域,而每条轻链包含一个恒定域和一个可变域。分子内二硫键稳定结构域,分子间二硫键将四个链固定在一起。它们共同构成了您从教科书中熟悉的表征 Y 形状。

20-FLE-62535 博客 1 图 5A_1

图 5. 每个抗体大分子由两条重链和两条轻链多肽组成,通过二硫键连接在一起。

 

抗体中蛋白水解切割位点的存在使得能够被胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等酶消化,从而产生具有不同特征的抗体片段。抗体的效应端称为 Fc 片段。这在免疫反应期间与各种免疫细胞上的 Fc 受体相互作用。源自重链的 Fc 片段的蛋白质序列在相同同种型的所有抗体中高度保守。抗体的抗原结合端称为 Fab 片段,正如您所料,它在抗原识别中起着至关重要的作用。Fc 片段通过重链中靠近切割位点位置的铰链结构域与 Fab 片段分离。

20-FLE-62535 博客 1 图 5B_1

图 6. 酶促断裂可用于产生抗体片段

 

当抗体遇到其抗原时,会发生非共价、可逆的结合事件。这可能是由氢键、疏水和静电相互作用以及范德华力的组合介导的。抗体和抗原之间结合的整体强度由两个关键特性决定 - 亲和力和亲合力。

 

抗体亲和力

首先,让我们来看看亲和力。这是说抗原结合位点和表位之间相互作用的强度,通常通过平衡结合常数 Ka 来衡量。Ka 定义为平衡时存在的抗体-抗原复合物的量,或更简单地描述抗体与其抗原结合的速度以及两者保持结合的时间。与具有低 Ka 的低亲和力抗体相比,具有高 Ka 的高亲和力抗体将在更短的时间内结合更多量的抗原。

亲和力 1

现在让我们更进一步。另一种考虑亲和力的方法是解离常数 Kd。这只是抗体-抗原复合物分离的速率。

亲和力 2 KaKd 都受到多种因素的严重影响,例如:

  • 反应大小
  • 缓冲液成分
  • pH 值和温度。

在遵循或优化实验步骤时,请务必记住,这些变量都可能影响您的实验结果。

抗体亲合力 (活性)

接下来,让我们考虑一下亲合力,这是事情变得更复杂的地方。亲合力指的是抗体-抗原复合物的整体强度。它不仅受可用抗原结合位点数量的影响(更广为人知的是抗体价),而且还受每个结合位点对抗原亲和力的影响。为了将效价放在上下文中,回想一下我们谈到最简单的抗体单元时,一种由两条重链和两条轻链组成的结构,具有两个相同的抗原结合位点。这是二价抗体。大多数研究抗体是二价的。然而,存在具有两个以上抗原结合位点的天然抗体,例如 IgA 和 IgM,并且还可以设计能够检测同一目标上两个不同表位的双特异性抗体。虽然 IgG 抗体中的抗原结合位点对其抗原的亲和力往往比 IgM 的抗原结合位点更高,但 IgM 分子是五聚体这一事实意味着它们有十个结合位点,而 IgG 只有两个结合位点。这提高了 IgM 抗体的亲合力。 

U1-F6图 7. 一个 IgG 分子有两个抗原结合位点,而一个 IgM 分子有十个,因此 IgM 比其他免疫球蛋白分子具有更高的亲和力。

 

这里还值得一提的是,多克隆抗体通常比单克隆抗体具有更大的亲合力,因为多个多克隆抗体可以结合一个目标。此外,抗原的呈递可能会受到不同免疫测定中使用的样品处理方法的影响。这些可能会增加或减少抗原可用性或改变表位的结构,从而影响亲合力。

在选择和使用抗体时,亲和力和亲合性不是唯一要考虑的属性。您还应该考虑抗体的特异性、选择性和灵敏度。

抗体的特异性和选择性

首先,让我们从两大误区聊聊抗体特异性。误区一:虽然许多科学家知道抗体特异性,但有些人可能不明白抗体选择性也是一个重要的概念。所以,让我们来定义和区分这两个术语。特异性指的是抗体区分其表位或决定抗原性的蛋白质区域的能力,选择性值得是抗体在复杂混合物中与其预期目标分子结合的程度。

当我们考虑特异性时,可能很容易以为对特定抗原具有高亲和力和高亲合力的抗体就是具有高度特异性的。事实上,情况并非一定如此。虽然特异性由抗体识别和结合其预期表位的能力定义,但它与抗体-抗原相互作用的强度无关。为了更好地解释这一点,让我们看一个典型的例子——生产用于研究的抗体的工作流程,即用感兴趣的抗原对动物进行免疫。由此产生的抗体库将包含具有相似特异性的高亲和力和低亲和力抗体,但免疫系统通常有利于产生高亲和力抗体的 B 细胞的扩增。当从免疫动物中分离 B 细胞并进行筛选以识别那些产生适合用作研究试剂的抗体的细胞时,必须进行严格的选择过程,以确保可以分离出高亲和力和低亲和力的抗体。这样,高度特异性但低亲和力的抗体就不会被忽视。

U1-F7

图 8. 如果低亲和力抗体具有高度特异性,它们可能仍然有用。 

 

现在让我们说说选择性,记住它指得是抗体在复杂混合物中与其预期目标结合的程度。尽管高度特异性的抗体会在给定的应用和实验环境中检测其抗原,但所有抗体都有可能与样品中可能存在的其他生物分子结合。只有一些抗体对所需的表位具有特异性,并且对所需的全长目标蛋白具有选择性,如下面图 9 中假设的蛋白质 1 的场景所示。即使抗体可能对单个表位具有特异性,该表位序列也可能存在于其他相关或甚至不相关的蛋白质中,并且可能导致抗体具有低选择性。针对蛋白质 2 生产的抗体就说明了这种情况,该抗体识别的表位也在相关蛋白质中表达。请注意,虽然许多研究人员可能认为这种抗体是非特异性的,但从技术上讲,将其称为“非选择性”更为准确。非选择性但特异性的抗体可用作“泛反应性”工具,前提是对结果的解释说明检测到多种同种型或蛋白质靶标的可能性。如果抗体检测到所需表位,但也与一个或多个其他表位发生交叉反应,则该抗体既不具有特异性,也不具有选择性,如蛋白质 5 的抗体示例所示。这种脱靶结合或交叉反应的程度可以根据实验条件和靶标的相对丰度而变化,这意味着选择性差的抗体可能会在实验过程中对不需要的背景信号产生显著影响。最后,我们考虑检测蛋白质 7 中多个表位的多克隆抗体。严格地说,多克隆抗体并不特异,因为它识别的表位不止一个。然而,它可以说是选择性的,因为该多克隆只检测到目标抗原。

 

U1-F9-nolable 图 9. 要了解抗体特异性和抗体选择性之间的差异,请分别关注检测到的表位和检测到的蛋白质。 

灵敏度以及实验环境如何影响抗体特性

尽管抗体的亲和力、亲合力、特异性和选择性在确定抗体的整体性能和灵敏度方面都起着重要作用,但它们对实验结果的影响在很大程度上取决于使用抗体的环境。一些研究人员可能会将与检测低丰度抗原的能力相关的灵敏度视为抗体的特性。例如,在表征组织模型中靶标的内源性表达水平时,选择两种抗体中更敏感的抗体是有意义的,而在靶标过度表达的细胞系模型中,敏感性就不是那么重要了。然而,更准确地说,灵敏度是免疫测定的特性,而不是抗体的特性。这就是抗原的呈递和浓度、缓冲条件(天然与变性)、温度、时间和抗体量等因素的来源。在一种免疫测定中高度特异性的抗体在不同的免疫测定中可能表现出较高的交叉反应性和较低的特异性。同样,一个供应商的抗体在 ELISA 中可能比第二个供应商的抗体表现出更高的灵敏度,但第二个抗体在免疫组织化学中表现出更高的灵敏度。所有这些变量都会影响亲和力、亲合力、特异性和选择性,从而影响给定免疫测定中的抗体灵敏度和性能。因此,在研究之前,您必须确认您在实验中使用的每种抗体都已经针对您的模型系统和应用进行了测试、验证和优化。

 

了解更多

继续阅读 Antibody Essentials 第 2 部分:如何对抗体进行分类

参考文献

  1. Price R. (2017) How the Reproducibility Crisis in Academia is Affecting Scientific Research. Forbes.com
  2. Baker M. (2015) Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature 2015 521, 274-276
  3. Baker M. (2016) 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature 533, 452-454。
  4. Begley C. M., Ellis L. M. (2012) Raise standards for preclinical cancer research. Nature 483, 531-533

 

相关帖子

确定蛋白质状态的工具

翻译后修饰 (PTM) 是一种关键的调控机制,可让细胞严格......
Andrea T 2021 年 12 月 08 日 03:00:00

进行基因组分析的工具

在过去数十年,基因组概况分析时使用的技术已取得长足进步。研究人员现在可以......
Curtis D 2021 年 12 月 01 日 03:00:00

为什么在流式细胞术实验中使用活力染料?

活性染料在细胞计数和传代、评估化学毒性以及.....进行流式细胞术实验时被广泛使用......
Rob M 2021 年 11 月 17 日 03:00:00
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink