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Antibody Essentials 第 2 部分:抗体多样性和分类

在设计实验和生成可重复数据时,了解抗体的制备方式以及不同类型抗体的优缺点至关重要。在这里,我们将查看给抗体带来令人难以置信的功能多样性的生物学机制,并考虑对抗体进行分类的各种方式。

如您所知,抗体是一种复杂的蛋白质,由特定类别的免疫细胞(称为 B 细胞)在适应性免疫反应过程中产生。免疫系统需要能够识别在动物的一生中可能遇到的数千种不同的潜在病原体,但抗原数量几乎无限,那 B 细胞如何产生针对所有这些潜在目标的抗体?为了解决这个问题,让我们简要探讨一下 B 细胞如何发育的一些基础知识,以了解它们在免疫学中的作用。

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抗体多样性是如何产生的

在骨髓和脾脏成熟后,每个循环 B 细胞表达独特的 B 细胞受体 (BCR)后者由膜免疫球蛋白(抗体)和相关的 Igα/Igβ(CD79a /CD79b)异二聚体组成。当 BCR 遇到并识别抗原时,B 细胞会内化并处理抗原。抗原片段与 MHC II 类分子结合形成复合物,该片段-MHC II 类复合物最终展示在 B细 胞表面。T 辅助 (Th) 细胞上的受体识别复合物并结合它,激活 Th 细胞,进而产生激活 B 细胞成为增殖性 B 浆细胞的细胞因子。这导致一群相同的、分泌抗体的浆细胞快速克隆扩增,这些浆细胞募集免疫细胞以杀死病原体并促进免疫系统清除抗原。尽管许多浆细胞寿命很短,但仍有一部分细胞存活下来成为记忆 B 细胞,在随后接触相同抗原时发挥保护功能。适应性免疫的有效性取决于每个 B 细胞克隆在其表面表达不同的抗体这一事实。那么,它来自哪里呢?

Essentials_2_F1a图 1. B 细胞通过表面的 MHC II 复合物显示抗原片段。 在免疫应答期间,Th细胞会刺激 B 细胞的克隆扩增,从而推动抗体产量的增加。 
 

B 细胞表面的抗体多样性是在 B 细胞发育早期、成熟之前通过一个过程实现的,该过程包括编码抗体重链和轻链的基因的 DNA 重排。这是通过三个主要机制发生的:V-D-J 重组、连接多样化和体细胞超突变。

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图 2. 参与抗体多样性产生的机制。
 

首先考虑 V-D-J 重组其是 B 细胞发育过程中不同变量、多样性和连接基因片段的剪接。每条抗体重链由单个恒定链基因拼接到一个可变基因片段、一个多样性基因片段和一个连接基因片段产生,而轻链由 V (kappa/κ 或 lambda/{ ut14}λ) 和 J 段,但不包括 D 段。可用的 V、D 和 J 基因片段的绝对数量(参见图 2),以及淋巴细胞特异性重组酶复合物对片段的随机重组,导致了数百万种可能的遗传配置。多样性可通过连接的多样化进一步增加,即当 V(D)J 酶复合物连接 V 区编码序列时,随机核苷酸从 V 区编码序列的末端丢失或在末端添加。

一旦VDJ重组和连接多样化完成,重链和轻链基因序列以正确的顺序排列以产生功能性抗体多肽。然而,基因重组会引起第三层级多样化,体细胞突变。体细胞超突变涉及重链和轻链可变区中点突变的积累,并在 B 细胞活化后发生。这些突变率比其他基因的背景突变率高约一百万倍,以进一步使抗体库多样化。随着适应性免疫反应的进行,这会产生更高亲和力的抗体,这一过程称为亲和力成熟。总之,这些多样化机制允许产生能够响应数十亿种独特抗原的抗体,足以实际上确保对任何非自身抗原的免疫反应。

进一步阅读:

Janeway CA Jr、Travers P、Walport M , et al. The generation of diversity in immunoglobulins.in Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. New York: Garland Science; 2001.  

 

抗体如何分类

我们已经考虑完抗体多样性背后的机制,是时候考虑抗体分类了。抗体通常以多种方式分类,例如:

  • 靶标反应性
  • 物种反应性
  • 用于免疫/抗体生产的宿主物种
  • 多克隆或单克隆
  • 仅限研究用途、诊断用途或治疗用途
  • 重组或非重组抗体生产

 

靶标反应性

当您开始选择用于实验的抗体时,您可能首先想到的是目标反应性。既具有特异性又具有选择性的充分表征的抗体将与其目标生物分子(最常见的是蛋白质)反应并结合,并且不会与脱靶分子反应。靶标蛋白的名称通常包含在抗体产品的名称中,以表明预期的目标反应性。对于许多靶标,将有不止一种抗体与靶标反应,它们可以识别同一靶标的不同表位,并且性能特征略有不同。因此,在设计实验时深入研究验证数据并详细了解每个数据非常重要。如果使用得当,特异性但选择性较低的抗体可能仍然是有价值的工具。一个例子是这种泛钙粘蛋白抗体,它与在钙粘蛋白家族的多个成员中表达的保守抗原反应。使用泛特异性抗体进行筛选实验后,可以使用更具选择性的抗体对该家族中的单个靶标进行检测。

许多蛋白质会经历翻译后修饰 (PTM),例如磷酸化、裂解、甲基化、泛素化或乙酰化,这是正常或病理生物过程中细胞信号活动的功能。PTM 可以激活或制止蛋白质的信号转导或其他功能。修饰特异性抗体,顾名思义,将与在特定氨基酸残基处携带特定类型修饰的靶标反应,而不与未修饰的靶标反应。实验中,若包含识别目标蛋白的特异性修饰抗体和总表达水平(修饰 + 未修饰)的抗体,会很有用,这样可以确认修饰抗体读数的变化是上游激活带来的结果,而非目标蛋白表达变化带来的。 

其他抗体已经开发出来,具有针对点突变和其他类型突变的特异性。 点突变特异性抗体只会与带有特定氨基酸取代的靶蛋白发生反应。融合特异性抗体仅识别由框内融合突变产生的蛋白质,例如 SS18-SSX 融合蛋白,不太常见。截断突变可以通过设计实验来探测,这些实验结合了识别截短蛋白质的 N 端和 C 端的抗体。识别癌症等疾病过程中涉及的突变的抗体可能会继续开发为临床诊断工具(见下文)。

 

物种反应性

不要与下一段描述的抗体宿主物种混淆,物种反应性是指目标蛋白的物种。例如,在小鼠中表达的许多蛋白质将具有在其他哺乳动物物种中表达的同源物或进化上相关的蛋白质。在某些情况下,针对小鼠抗原产生的抗体只会与小鼠同源物反应,而不与该蛋白质的人类或大鼠同源物反应。其他抗体将能够与来自多个物种的同源物反应。抗体是否具有广泛或狭窄的物种反应性主要受表位序列保守程度的影响;高度保守的表位更有可能产生可以针对多个物种的靶标进行验证的抗体。您需要选择一种具有适合您的实验模型的物种反应性的抗体。所以对于小鼠细胞系的实验,你会寻找小鼠物种的反应性,但如果使用人类细胞系,你会寻找针对人类的反应性的抗体。在外源表达模型的情况下,例如在小鼠细胞系中表达人类蛋白质,那么您需要选择具有人类反应性并且也不与小鼠同源物反应的抗体,或者将小鼠同源物敲除或在外源表达的蛋白质上编辑一个表位标签,也是可能的。

 

宿主

抗体也可以根据产生它们的物种进行分类。兔、小鼠和大鼠是最常用于产生研究抗体的宿主物种,尤其是在单克隆抗体的情况下。这部分是因为这些物种的畜牧业相对简单。尽管多克隆抗体可以在小鼠或大鼠中产生,但它们通常在较大的动物中制成,例如兔、山羊、驴或绵羊,从这些动物中更容易收集大量血清。多重免疫分析的一种常见方法是将针对不同目标的一抗(每个来自不同的宿主物种)与与不同荧光团偶联的二抗相结合。在此实验设计中,根据一抗中恒定区的物种特异性,每种二抗将仅识别一种一抗。例如,“山羊抗小鼠 IgG”二抗是在山羊宿主中产生的,它将识别由小鼠宿主产生的一抗。与荧光染料偶联后,可以在显微镜、流式细胞仪或其他仪器中检测和读出每个靶标。然而,跟踪关键细节(例如宿主物种和同种型)至关重要,并且所有一抗和二抗都必须针对其预期用途进行充分验证。否则,将获得误导性的结果。

同种型和子类

在哺乳动物中,抗体根据它们包含的重链分为五种主要同种型或类别。这些被称为 IgG、IgA、IgD、IgE 和 IgM,其中重链分别是 γ、α、δ、ε 或 μ。重链在恒定域的数量和序列以及铰链区的结构方面有所不同,并且在某些物种中允许将每个抗体同种型进一步划分为亚型。例如,在人类中,IgG 同种型分为四个亚型或亚类(IgG1 到 IgG4),而在小鼠中则存在五种不同的 IgG 亚型。兔子只有一种同种型:IgG. 具有不同靶点特异性但具有相同亚型的抗体在其恒定域中将具有相同的序列。因此,如果被胃蛋白酶切割,它们将产生相同的 Fc 片段。也有可能针对同一抗原产生来自不同物种、同种型或亚型的两种或多种抗体。

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图 3. 可用的抗体同种型和亚类的数量因物种而异。  

 

通过在同一实验中组合不同同种型或亚型的抗体,可以为多重实验设计增加另一层复杂性。例如,可以区分小鼠 IgG1 与小鼠 IgG2a 的亚类特异性二抗将与来自这些亚类的一抗结合使用。值得一提的是,在所有哺乳动物中,根据 B 细胞成熟过程中选择的轻链基因位点,将抗体轻链分为 kappa 或 lambda。轻链的类型是另一种抗体特性,可以利用它来实现多路复用。同样重要的是要注意,非哺乳动物物种具有与哺乳动物不同的抗体同种型。例如,鸟类会产生 IgY 抗体,而硬骨鱼(如虹鳟鱼)会产生 IgT。同样,检测不同的同种型依赖于合适的、经过彻底验证的二抗试剂的可用性。最后,抗体同种型之间的另一个主要区别是效价。虽然 IgG、IgD 和 IgE 是二价的,但 IgA 的价数为 4,而 IgM 的价数为 10。正如我们在第一篇 Antibody Essentials 博客中看到的,如图 4 所示,价数越大,抗原越多免疫球蛋白分子能结合,且其亲和力越高。

克隆性(多克隆与单克隆)

另一种对抗体进行分类的方法是考虑它们是多克隆还是单克隆;两者之间的主要区别是指产生它们的 B 细胞。多克隆抗体源自混合或异质 B 细胞群,这意味着一管多克隆抗体实际上将包含许多不同的抗体。如果多克隆抗体具有高度选择性,则该混合物中的抗体将与靶蛋白内的多个表位结合,但不会与任何其他表位结合。另一方面,单克隆抗体是由相同的 B 细胞产生的,因此一管纯化的单克隆抗体将包含同一抗体的多个拷贝,并且应该结合单个表位。最重要的是,如果可用,单克隆抗体比多克隆抗体提供更一致的性能,这一主题将在 Antibody Essentials 的第 4 部分中进行更详细的探讨。

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图 4. 经充分验证的单克隆抗体应特异性识别单个表位,而经充分验证且具有选择性的多克隆抗体仍应与单个靶蛋白结合,但通过识别多个表位来实现。

仅供研究使用 (RUO) 的抗体

一个重要的抗体分类涉及使用抗体的环境。如果您在学术研究实验室工作,您很可能使用标有“仅供研究使用”(有时缩写为 RUO)的抗体。这些用于非诊断性、基于实验室的实验。RUO 抗体的验证测试应根据目标的生物学作用以及与预期应用相关的使用方法、实验步骤和控制材料进行设计。例如,被认为对蛋白质印迹有效的 RUO 抗体应提供其适用于蛋白质印迹应用的明确实验证明,数据显示其对阳性和阴性对照的性能。如果抗体将用于免疫组织化学或流式细胞术等其他应用,则此验证数据不适用,因此您应该寻找与您将使用的应用相关的验证。与治疗性抗体相比,RUO 抗体通常不受严格监管,最终由您决定是否信任抗体验证数据以及您对实验数据的解释,足以发布结果。

治疗性抗体

与 RUO 抗体相反,治疗性抗体旨在用于患者。治疗性抗体的特殊之处在于它们具有可用于治疗疾病的生物活性。治疗性抗体的作用机制可能是阻断配体-受体相互作用,中断信号级联反应,或用辐射或不同形式的细胞毒性靶向肿瘤细胞以杀死它们。这意味着它们需要一种非常不同的验证方法,或者在这个领域更常提到的验证。治疗性抗体不是仅依赖于特定应用的验证,而是通过其治疗功效、安全性和制造工艺进行评估,从而使用正式的工艺表征来确保临床试验中的患者安全。这受到 FDA 等机构的严格监管,它们有权批准或拒绝治疗性抗体,就像对待任何其他药物一样。可以想象,开发 FDA 批准的疗法的成本远高于 RUO 抗体!

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图 5. 与 RUO 抗体相比,用于诊断和治疗用途的抗体必须满足更严格的验证标准才能获得批准。

 

临床诊断抗体

位于 RUO 抗体和治疗性抗体之间的诊断抗体用于临床环境中患者来源的样本。在这里,它们是用于诊断病原体感染、癌症、代谢或免疫疾病以及许多其他医疗状况的标准化检测的重要工具。尽管包括 IHC 和 ELISA 在内的一些免疫测定可以结合 RUO 或诊断用途抗体,但临床诊断用途需要由管理机构(例如临床实验室改进修正案 (CLIA))进行额外级别的验证和认证。需要注意的是,虽然抗体开始时可能会被标记为 RUO,但如果它通过了必要的认证,它也可以进一步开发为诊断或治疗药物,后者通常会被赋予不同的“品牌”名称以用于营销目的,使它们成为研究应用的首选。

 

重组抗体

另一种进一步分类单克隆抗体的方法是考虑它们是使用传统方法还是重组方法生产的。更准确地说,让我们考虑重组单克隆抗体的生成和生产之间的差异。您可能已经阅读过关于使用噬菌体和酵母展示文库作为高通量抗体发现的无动物环境。这可以被认为是重组抗体的产生。请注意,重组单克隆抗体的生产不仅限于已在体外产生的抗体。也可以从动物的常规免疫开始生产重组抗体,以引起免疫反应和 B 细胞的扩增。在成熟 B 细胞的分离和克隆扩增(在 Antibody Essentials 的第 4 部分中介绍)之后,重链和轻链的基因被克隆和测序。这是重组抗体的显著特征:它的基因和肽序列为开发它的科学家所知,从而能够在细胞培养中表达抗体以进行放大生产。重组单克隆抗体生产通常是许多研究应用的首选,可提供持续的抗体供应,更重要的是,对于最终用户而言,它们具有更高的批次间一致性和可靠的性能。

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图 6. 多克隆、单克隆或重组单克隆抗体的抗体生成、生产和验证工作流程概述。 

 

由于它们经过测序并适合工程化,因此重组抗体作为治疗剂的使用正在增加,主要例子是抗体-药物偶联物的开发。其他治疗方法包括在动物宿主物种中开发的物种转换或人源化抗体,以降低免疫原性和人类抗小鼠抗体 (HAMA) 反应; 生产单链可变片段以保持特异性,同时显著降低抗体大小; 以及能够同时结合两个不同表位的双特异性抗体的产生。

归根结底,抗体的分类取决于其生产方法、内在特性及其适用的应用。在为您的检测选择最佳抗体并满足您的研究和发表目标时,应考虑所有这些因素。

接下来,我们将深入探讨抗体技术的历史和演变,以及它如何为您今天的抗体使用决策提供信息。

 

接下来,Antibody Essentials 第 3 部分:抗体技术如何发展

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