CST 博文: 实验室展望

Cell Signaling Technology® (CST) 的官方博客,我们在此讨论您从工作台上可期望获得什么,分享提示、技巧和信息。

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Antibody Essentials 第 3 部分:抗体技术如何发展

自从发现抗体以来,数十年的研究和开发推动了技术进步,使我们走到了今天——能够轻松购买抗体作为科学研究的现成试剂。了解基于抗体的技术的背景和历史发展将帮助您了解抗体在现代实验技术中的用途和局限性。虽然购买抗体用于您的研究比以往更容易,但我们鼓励您考虑抗体时就像您自己生产抗体一样。这将大大增加您产生可以信赖的结果的机会。

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抗体:起源故事

发现抗体并将其用作基本研究试剂的道路始于 18 世纪早期的第一次天花接种研究。通过将人类天花患者疮口的物质转移到健康人皮肤上的划痕中,证明可以预防未来的天花感染。重要的是,这些实验提供了一些关于免疫机制的最早见解。出于安全考虑,Jenner 于 1796 年采用了从患有牛痘(一种比天花温和得多的疾病)患者疮口中提取的材料,采用了该方法。Pasteur 随后在 1885 年引入了进一步的改进,当时他使用减毒病毒来提供保护而不会冒疾病发展的风险。

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图 1.左上角:英国乡村医生爱德华詹纳于 1796 年在伯克利进行了第一次天花疫苗接种。(来源:美国 Nat'l 医学图书馆。)右上:美国战争信息办公室 (OWI) 员工免费接种天花、白喉和伤寒疫苗。 (来源:美国国会图书馆。)底部:Paul Ehrlich 的侧链理论为发现抗体奠定了概念基础。 (来源:Wellcome Collection。)

 

在此之后,了解和利用免疫反应的进展相对较快地推进。19 世纪后期,冯·贝林和 Kitasatu 因发现从感染破伤风或白喉的兔子身上提取的血清可以赋予小鼠抗病能力而获得诺贝尔奖。这一发现随后是 Ehrlich 的侧链理论,他假设免疫细胞被能够特异性结合外来物质的受体所覆盖。根据 Ehrlich 的说法,一旦发生这种相互作用,免疫细胞就会被激活以产生更多的受体,然后这些受体将被释放到血液中以帮助消除不需要的物质。侧链理论被广泛认为是对我们现在所知的抗体的第一个描述。此后,有人提出了对抗体-抗原结合假说的解释,此后不久 B 细胞被确定为抗体的来源。

 

利用抗体作为研究工具

20 世纪下半叶见证了抗体分子结构的确定和杂交瘤技术的发明,其中包括在体内引发免疫反应从而扩大和选择 B 细胞克隆(详细介绍在 Antibody Essentials 的第 4 部分)——分别为 Edelman 和 Porter 以及 Jerne、Köhler 和 Milstein 提供诺贝尔奖。

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图 2. 顶行: Gerald M. Edelman 和 Rodney R. Porter; 底行:Niels K. Jerne、 César Milstein 和 Georges J.F. Köhler。 (来源:美国 Nat'L 医学图书馆(左上图和左下图);MRC 分子生物学实验室(右下图)。)

 

当时还发明了许多免疫测定技术,包括流式细胞术、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、蛋白质印迹和染色质免疫沉淀 (ChIP)。随着聚合酶链反应 (PCR) 和相关现代分子克隆技术的发展,杂交瘤技术得到了各种用于产生抗体的重组方法的补充,大大扩展了可用抗体工具的多样性。另一个值得注意的发展是 Harlow 和 Lane 的著作 - 《抗体:实验室手册》 的出版。 1988 年出版后,这本书很快就出现在世界各地的实验室和科学图书馆的书架上,迅速成为想要为研究开发抗体的科学家的首选参考书。U3-F3

图 3. Harlow 和 Lane 的书《抗体:实验室手册》,现在仍然是开发新型抗体的实验室和核心设施的首选参考工具。照片:Xiqiang Hong。

 

在 90 年代,技术进步还导致了可以特异性检测翻译后修饰的抗体的开发,首先是磷酸化特异性抗体,然后是检测甲基化、乙酰化和其他蛋白质修饰的工具。这很重要,因为这种修饰与蛋白质激活状态和生物功能的变化有关,例如打开或关闭信号通路,这意味着这些抗体试剂为表征信号活动开辟了新的和令人兴奋的可能性。这也是 Cell Signaling Technology (CST) 成立的时期。渐渐地,科学家们可从 CST 和其他供应商处购买的研究抗体数量开始增加,为过去十年商业抗体呈指数级增长奠定了基础。今天,当需要为您的实验购买抗体时,您可能有很多选择,这当然取决于您选择的目标和应用。引用 RUO 抗体的出版物数量逐年稳步增长。

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图 4. 2005-2019 年所有供应商的一抗出版物中的唯一引用次数。(Source: CiteAb.)
 

采集抗体:未来与现在

如此多的抗体很容易获得,研究出版物也很容易发表这些抗体的结果,为什么会出现可重复性危机?部分原因可能是现在购买抗体并将其投入免疫测定几乎简单,而这在以前是不可能的。为帮助您了解抗体研究领域的变化,让我们回到 80 年代或 90 年代,那是杂交瘤和分子克隆技术可用、但许多抗体尚未商业化。

 

假设您是这个时期的科学家,在大学实验室工作,您正在研究一种尚未完全了解的新型靶蛋白。您正在撰写研究奖学金,并希望产生新的出版物。显然,您无法购买针对刚刚发现的蛋白质的抗体,因此作为研究目标之一,您建议开发多克隆或单克隆抗体以用于您的实验。您的研究计划可能涉及在几种不同的应用中使用新抗体、修改现有的实验方案,甚至设计新的检测方法。 U3-F4

图 5.1980 年代的一个研究实验室,在商业 RUO 抗体广泛可用之前。 (来源:美国 Nat'l 医学图书馆。)

 

请记住,在过去的几十年中,可用于设计验证测试的有关目标蛋白质的文献中的整体知识较少。因在开发和验证与您的蛋白质和未知蛋白质发生反应的新型抗体时,您可能对共享功能、结构或序列同源性的相关蛋白质知之甚少。在验证您的抗体时,您还希望了解最新文献以纳入新信息,例如有关亚细胞定位、翻译后修饰或涉及您的蛋白质的结合相互作用的详细信息。科学知识建立在自身之上,其中一些知识为抗体开发和验证提供信息。

 

同行评审和试剂验证如何关联?

从早期几十年到今天仍然存在的学术研究情况是——获得资金和发表文章的双重和相互依赖的需求。在资助撰写、研究执行和手稿出版的整个过程中,您总是期待着来自同行评审员的批判性的评论。(还有一位教授在研讨会期间总是坐在前排并提出最尖锐的问题。每个部门至少有一个。)这激发了设计更好的实验,这些实验可以经得起同行评审并支持更有力的结论。

 

由于稳健的实验设计适用于研究的所有方面,在我们 1980 年代的情景中,您可以确定同行评审员希望看到数据来支持您使用的抗体在应用和分析中具有特异性和敏感性。换句话说,您需要花更多时间来生成验证数据,然后才能发布。从免疫到多克隆抗体需要几个月的时间,开发单克隆抗体可能需要长达一年或多于一年的时间,而验证测试可能会增加更多的时间。您将设计和执行自己的抗体验证测试,并优化您的实验步骤。可以肯定的是,这将是您花费大量时间思考的事情。然而,在实验放大和数据收集和分析之前的所有这些准备时间都是值得的,因为您将能够信任您的结果并在发表文章时充满信心。

现代 RUO 抗体市场

现在让我们快进到今天。仍然有一些研究实验室选择制造和验证自己的抗体,例如研究一些专门研究领域或使用不太常见的模式生物物种的实验室。但更有可能的是,您的第一直觉是阅读文献并在 Google 或百度中输入搜索词,或者转到以试剂为重点的购物引擎,例如 BiocompareCiteAb ,或抗体资源。这使您可以比较抗体,然后再选择购买并运送到您的实验室。今天,抗体最终用户(即研究人员)已经意识到我们在第一个 Antibody Essentials 博客中介绍的可重复性危机。在试剂选择和购买过程中,他们将评估抗体制造商提供的验证数据,并与其他科学家使用该抗体生成的已发表在研究期刊上的数据进行比较。

 

然而,这是一个转变的观点——与其半夜醒来担心如何验证您的抗体,您可能会认为验证是抗体供应商的责任。老实说,在查看供应商的验证数据时,您可能会或可能不会拥有与您自己设计和执行验证测试时相同的批判性眼光,并期望同行评审对其进行详细剖析和分析。也有研究论文变得更长更密集的情况,这意味着抗体验证数据往往会被塞进补充方法部分,很容易被遗漏,或者可能完全被省略。总体而言,抗体验证审查的减少和抗体在预期应用或生物模型之外的无意滥用,甚至包括被许多研究引用的抗体,都导致了可重复性危机。

 

当您在 Google 上搜索并浏览抗体供应商网站时,您可能会发现在验证方面可用的信息存在很大差异。您可能看到多家供应商将抗体销售至同一靶点,但对其中一些抗体的验证不支持在所需应用中的特异性和灵敏度。或者,验证数据中可能缺少关键细节,例如使用了哪些细胞系、如何应用治疗或准确地进行了哪些抗体稀释。这些缺点可能会导致难以确定验证数据的强度,从而可能导致对实验的误解和在文献中发表不可重复的研究。

 

许多供应商自行执行验证测试,这是所有 CST 抗体的标准做法。但您可能不知道还有其他一些抗体被转售。换句话说,供应商没有在他们的设施中生产和验证抗体,而是从第三方购买抗体并将他们的标签贴在管子上。许多这些重新命名的抗体在其预期应用中可以很好地工作,但是当您认为将两种不同的抗体与同一目标进行比较时,这可能会造成混淆,但实际上它们是由两个不同品牌出售的相同抗体。

 

另一个可变性来源可能是批次间验证的不同标准;一些供应商会针对每个推荐的应用重新验证每批新抗体,而其他供应商可能不会。正如我们将在下一篇 Antibody Essentials 博客中看到的,多克隆抗体产品的组成会随着时间的推移而变化,因此批次特异性验证对于这些试剂尤为重要。最后,值得注意的是,在全球某些地区,有报道称有不法供应商和转售商稀释产品甚至销售假冒抗体或研究试剂。幸运的是,政府、供应商和科学界正在采取措施打击这些活动。

 

为您的实验选择抗体时要问的问题

我们建议,当您购买市售抗体时或者当您从大厅里实验室的朋友那里“借用分装”时,您应该用与制造和验证您自己实验室里面的抗体相同的方式来考虑它。让自己站在 80 年代或 90 年代的科学家的角度,他们无法选择几种商业开发的抗体,每种抗体都与几篇出版物相关联。问问您自己:如果您做到了,您是否有信心将“验证数据”作为一个数字提交,知道它会引起同行评审员的注意?用于验证抗体的实验步骤是否与您的实验步骤密切相关?供应商验证中使用的组织或细胞是否在您的实验模型的已知背景下提供了适当的信息?如果您正在评估使用您正在评估的抗体的研究论文,作者是否提供了足够的详细信息,以确认他们“遵循制造商的实验步骤”使用,并且在必要时是否执行了额外的验证?

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图 6. 这些是您在查看供应商提供的抗体验证数据时应该问自己的一些问题。 

 

如果您对上述任何这些问题的回答为“否”,您可能会认为仍然值得对相关抗体进行先导性实验。但是,您需要使用与您选择的应用程序和模型系统相关的自己的验证测试来补充供应商的验证数据。只有在重新验证抗体并优化您的实验方案(必要时)之后,您才能继续扩大范围和数据收集。在编写方法章节和发表文章时,保留详细的实验室笔记本将有所帮助,以便同行评审员和读者能够准确了解您的结果是如何生成的。

因此,再次重申,供应商(包括 CST)、抗体用户(包括您)、科学导师和出版物之间有共同的责任,以确保正确验证、使用和记录抗体,从而提高可重复性。通过关注抗体的产生和验证方式,您可以更好地获得可靠且可重复的实验结果。

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图 7. 科学可重复性(包括在研究中负责任地使用抗体)需要整个科学界的持续合作。 

 

希望通过对抗体发现和进化过程的概述,我们能够认识到抗体对加速科学研究的重要性。接下来,在比较兔子和小鼠宿主抗体的优缺点之前,我们将更详细地研究多克隆和单克隆抗体。

 

接下来 —— Antibody Essentials 第 4 部分:多克隆与单克隆抗体。

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